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自身免疫性肝炎患者肝脏巨噬细胞极化分型研究

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中华内科杂志 2017年第10期56卷 763-765页

作者：郭丽萍周璐李虹霞张洁王邦茂天津医科大学总医院消化科 300052 天津市泰达医院

初步探讨并揭示自身免疫性肝炎（AIH）肝组织巨噬细胞的功能表型。研究结果发现，AIH患者肝组织CD68＋细胞绝对数显著高于非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、慢性乙型肝炎（CHB）（P均〈0.05），其与ALT及IgG水平均呈正相关，相关系数分别为... 详细信息

初步探讨并揭示自身免疫性肝炎（AIH）肝组织巨噬细胞的功能表型。研究结果发现，AIH患者肝组织CD68＋细胞绝对数显著高于非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、慢性乙型肝炎（CHB）（P均〈0.05），其与ALT及IgG水平均呈正相关，相关系数分别为0.600、0.700（P＝0.285，P＝0.188）；AIH、CHB患者肝组织的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性细胞绝对数以及TNFα、iNOS、IL－1β相对表达量均显著高于NAFLD患者（P均〈0.05）；NAFLD患者肝组织CD206＋细胞绝对数显著高于AIH、CHB患者（P均〈0.05），CD206相对表达量高于AIH、CHB患者，但差异无统计学意义。AIH患者炎症反应及肝损伤过程中巨噬细胞活化且似以M1促炎表型为主。

关键词：肝炎,自身免疫性巨噬细胞极化分型

自身免疫性肝炎患者肠屏障功能及肝脏巨噬细胞极化分型的研究

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自身免疫性肝炎患者肠屏障功能及肝脏巨噬细胞极化分型的研究

作者：郭丽萍天津医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究首先比较自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）患者、AIH肝硬化患者及健康对照者口服乳果糖（lactulose,L）和甘露醇（mannitol,M）双糖分子探针后尿液中二者的回收情况以评价各组肠屏障功能,旨在探索肠屏障功能改变... 详细信息

目的:本研究首先比较自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）患者、AIH肝硬化患者及健康对照者口服乳果糖（lactulose,L）和甘露醇（mannitol,M）双糖分子探针后尿液中二者的回收情况以评价各组肠屏障功能,旨在探索肠屏障功能改变、肠道来源的抗原如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）在AIH发生发展中的作用。另外,我们分析了AIH患者肝组织巨噬细胞极化分型分子的表达,旨在初步探讨并揭示AIH患者肝组织中巨噬细胞的功能表型。方法:第一部分:AIH患者肠屏障功能评价收集2015年1月-2016年1月于天津医科大学总医院消化科就诊的AIH患者5例和对照AIH肝硬化患者5例、健康对照者10例。收集各组受试者口服测试液之后6小时以内的所有尿液,利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）测定尿液中乳果糖和甘露醇的回收情况,计算尿液乳果糖/甘露醇比值也即L/M值以评价肠屏障功能。本研究经医院伦理委员会审核准许（IRB2015-YX-002）,所有患者均知情同意。第二部分:AIH患者肝脏巨噬细胞极化分型评价收集2015年1月-2016年1月于天津医科大学总医院消化科就诊的AIH患者5例和对照肝病患者6例、肝囊肿患者5例,行超声引导下肝穿刺活检术取得长约1.5cm的肝组织条。应用免疫组化法、免疫荧光染色法检测各组肝病患者肝组织中巨噬细胞的活化和极化分型情况。进一步通过RT-PCR法检测并验证肝组织中巨噬细胞的极化分型相关表面标志物和细胞因子。本研究经医院伦理委员会审核准许（IRB2015-YX-002）,所有患者均知情同意。结果:第一部分:AIH患者肠屏障功能评价（1）参与尿样收集的5名AIH患者、5名AIH肝硬化患者在口服测试液后耐受良好、过程顺利,无一人出现不良反应。10名健康对照者中1名（10%）出现轻微腹胀等不良反应,2名（20%）出现明显腹胀等中度不良反应,7名（70%）出现腹痛腹泻等重度不良反应,收集结束时3名（30%）健康志愿者未收集到尿液。（2）甘露醇回归方程:y=1.096x+6.510,乳果糖回归方程:y=1.032x+6.362,其中,x为标准品浓度的常用对数,y为标准品峰面积的常用对数。（3）健康对照组尿样中可检测到甘露醇,其回收量、回收率分别为92.35mg（14.60~209.4mg）,1.85%（0.29~4.19%）,未检测到乳果糖,l/m值为0.00（0.00~0.00）;aih患者尿样中乳果糖回收量、乳果糖回收率、l/m值与健康对照组相比,差异均无统计学意义,其甘露醇回收量362.22mg（176.67~515.36mg）、甘露醇回收率7.24%（3.53~10.31%）与健康对照组相比,差异有统计学意义（p=0.023、0.023）;aih肝硬化患者尿样中甘露醇回收量414.54mg（276.53~931.18mg）、回收率8.29%（5.53~18.62%）、乳果糖回收量33.40mg（6.80~48.31mg）、回收率0.37%（0.09~0.64%）及l/m值0.05（0.02~0.10）与健康对照组[92.35mg（14.60~209.4mg）、1.85%（0.29~4.19%）、0.00mg（0.00~0.00mg）、0.00%（0.00~0.00%）、0.00（0.00~0.00）]相比,差异均有统计学意义（p=0.021、0.021、0.014、0.014、0.014）;aih肝硬化患者尿样中乳果糖回收量33.40mg（6.80~48.31mg）、回收率0.37%（0.09~0.64%）、l/m值0.05（0.02~0.10）与aih患者[0.00mg（0.00~6.33mg）、0.00%（0.00~0.06%）、0.00（0.00~0.03）]相比,差异均有统计学意义（p=0.004、0.004、0.007）。第二部分:aih患者肝脏巨噬细胞极化分型评价（1）aih患者肝组织巨噬细胞数量增多:aih患者与脂肪肝患者、乙肝患者相比,cd68阳性细胞绝对数均显著增多（p=0.034、0.034）,脂肪肝患者与乙肝患者相比cd68阳性细胞绝对数间的差异无统计学意义。（2）aih患者肝组织m2型巨噬细胞相对低表达:脂肪肝患者与aih患者、乙肝患者相比,cd206阳性细胞绝对数显著增多（p=0.019、0.046）,aih患者与乙肝患者相比cd206阳性细胞绝对数间的差异无统计学意义;脂肪肝患者肝组织cd206相对表达量显著高于aih患者和乙肝患者[（8.08±1.63）比（1.03±0.12）、（2.36±1.32）],差异有统计学意义（p均＜0.05）,而aih患者和乙肝患者肝组

关键词：自身免疫性肝炎肠屏障功能巨噬细胞极化分型

巨噬细胞的极化分型在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展

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国际呼吸杂志 2014年第21期34卷 1671-1676页

作者：陈龙熊先智华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科武汉430022

巨噬细胞是单核巨噬细胞系统的终末分化细胞，由单核细胞分化而来。巨噬细胞通过吞噬作用参与非特异性免疫，在适应性免疫中主要发挥免疫调节及抗原递呈功能，从而影响机体全身代谢、造血、血管生成、凋亡、肿瘤和生殖等多种进程。COPD... 详细信息

巨噬细胞是单核巨噬细胞系统的终末分化细胞，由单核细胞分化而来。巨噬细胞通过吞噬作用参与非特异性免疫，在适应性免疫中主要发挥免疫调节及抗原递呈功能，从而影响机体全身代谢、造血、血管生成、凋亡、肿瘤和生殖等多种进程。COPD是一种机体对吸烟或吸入其他有害气体、颗粒物引起的异常炎症反应，病理学定义为持续存在的气流受限。它包括一系列病理过程，如大气道的炎症（慢性支气管炎）和小气道的气道重塑、弹性减退和肺间质的破坏造成的肺气肿。尽管引起炎症和肺部组织损伤的原因没有完全研究清楚，但单核巨噬细胞通过释放炎性介质在引起肺部炎症和肺气肿的过程中起到了关键的作用。巨噬细胞因其所处微环境的不同存在不同的分型，而且这种分型在COPD中也有了一定的进展，但吸烟对于巨噬细胞极化分型的影响仍颇有争议。现就巨噬细胞的极化分型在COPD中的研究进展综述如下。

关键词：巨噬细胞极化分型慢性阻塞性肺疾病

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间充质干细胞免疫调节的可塑性

中国科学：生命科学 2016年第7期46卷 799-808页

作者：黄庆雷魏晓飞北京市脐带血造血干细胞库北京100176

间充质干细胞(MSCs)因其独特的免疫调节及其他生物学特性,在组织损伤,免疫调控和再生医学领域受到了广泛的研究,并在临床试验中用于治疗一系列免疫相关的疾病.然而,临床试验结果表明,MSCs并不总是产生免疫抑制作用,有时会得到自相矛盾... 详细信息

间充质干细胞(MSCs)因其独特的免疫调节及其他生物学特性,在组织损伤,免疫调控和再生医学领域受到了广泛的研究,并在临床试验中用于治疗一系列免疫相关的疾病.然而,临床试验结果表明,MSCs并不总是产生免疫抑制作用,有时会得到自相矛盾的结果.最近的研究发现,MSCs既可以抑制免疫应答,也可以促进免疫应答,不同的炎症介质会诱导MSCs极化分型并表现出截然相反的免疫调节作用,这一特性称为MSCs免疫调节的可塑性.本文将重点阐述炎症微环境下不同促炎因子的浓度以及自身TLR3和TLR4激活后对MSCs免疫调节可塑性所起的主导作用,特别是NO/IDO可能在MSCs从免疫抑制向免疫促进转变的过程中起到分子开关的作用.深入了解MSCs免疫调节的可塑性和极化分型的概念,可以更好地指导MSCs在临床上的应用.

关键词：间充质干细胞可塑性免疫调节炎症微环境极化分型

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巨噬细胞调控伤口愈合研究进展

沈阳药科大学学报 2021年第3期38卷 321-327页

作者：杨燕玲孙湘婷黄浩陈垒赣南医学院药学院国家中药现代化工程技术研究中心客家中医药资源研究分中心江西赣州341000

目的综述巨噬细胞在伤口愈合中的调控作用研究进展。方法通过检索国内外相关文献44篇,着重介绍巨噬细胞的个体发育、来源、表型异质性以及巨噬细胞在伤口愈合过程中所扮演的生物学作用。我们也介绍了一些基因学、药理学和生物工程学方法... 详细信息

目的综述巨噬细胞在伤口愈合中的调控作用研究进展。方法通过检索国内外相关文献44篇,着重介绍巨噬细胞的个体发育、来源、表型异质性以及巨噬细胞在伤口愈合过程中所扮演的生物学作用。我们也介绍了一些基因学、药理学和生物工程学方法,通过干预巨噬细胞表型和功能来促进伤口愈合。结果伤口愈合是一个复杂的生物学过程,由四个连续又相互交错的时期组成。巨噬细胞在伤口愈合的不同时期和组织再生过程中扮演着重要作用。结论由于巨噬细胞在伤口愈合不同时期所扮演的重要作用,可作为一个潜在靶点,通过干预巨噬细胞表型和功能,开发一些新颖的临床治疗药物。

关键词：伤口愈合巨噬细胞极化分型炎症反应

NDV强、弱毒株致鸡巨噬细胞极化功能差异的机制

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NDV强、弱毒株致鸡巨噬细胞极化功能差异的机制

作者：张平仄吉林大学

学位级别：硕士

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus serotype-1,APMV-1)的代表种,其广泛分布于世界各地,也是严重危害世界家禽健康最主要的病原之一。尽管NDV只有单一血清型,但却存在着多种致病型与基因型。... 详细信息

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus serotype-1,APMV-1)的代表种,其广泛分布于世界各地,也是严重危害世界家禽健康最主要的病原之一。尽管NDV只有单一血清型,但却存在着多种致病型与基因型。NDV各基因型之间的基因组差异性很大。目前,国内外学者通常将NDV分为class I和class II两大类:class I型主要分离于野鸟和家禽,且绝大多数鉴定毒株为无致病性毒株;class II型通常分离自家禽及其他多种禽类,其从无致病性、低致病性、中等致病性到高致病性毒株均有,并构成了连续的毒力谱。其中的强毒株常引发新城疫(Newcastle disease,ND)疫情,并造成严重的经济损失,已成为危害养禽业发展的主要病毒之一。Class II型NDV又可细分为16个基因型;当前,在世界范围内,所流行的ND以class II NDV中的基因VII型毒株为主,但近年来class I型NDV的分离率也在不断增加。NDV感染后引起机体各组织不同程度的病理反应及临床症状,反映了NDV致病能力的高低,然而,对产生该差异的原因,迄今尚未完全明确。巨噬细胞作为宿主天然免疫系统的重要组成部分,是一类重要的免疫效应细胞,其可通过极化分型并分泌细胞因子来调节炎症、抵御病原的感染。同时,巨噬细胞还能够表达多种Toll样受体(TLRs)以识别病原体相关分子模式(PAMP)从而启动宿主天然免疫应答,其中,TLR7是抵抗病毒感染过程中的关键分子。目前,关于鸡巨噬细胞的抗病毒功能研究还鲜有报道,鉴于此,本研究分别以class II型NDV强毒株、class II型NDV弱毒株及class I型NDV弱毒株感染鸡巨噬细胞(HD11),通过检测鸡巨噬细胞在不同感染时间点上病毒载量、极化标志基因和抗病毒因子的m RNA表达水平,以比较不同毒力NDV感染所致鸡巨噬细胞极化分型的差异与影响,并在此基础上,进一步探讨了激活的TLR7对NDV强弱毒感染后鸡巨噬细胞中病毒载量、极化分型及其抗病毒感染的作用机制,旨在阐明不同毒力NDV感染所引起的病理反应差异的原因,为抗感染免疫调节剂的筛选和研发提供确凿依据。本研究主要内容如下:***强、弱毒株感染对鸡巨噬细胞极化分型的影响本研究首先以本实验室分离、鉴定及保存的class I型NDV F55株为参考毒株,成功建立了针对class I型NDV的实时荧光定量PCR检测方法。之后,选取2株不同毒力的NDV毒株(class II基因VII型强毒株NA-1、class II基因II型弱毒株La Sota)以及1株class I型弱毒株F55分别感染鸡巨噬细胞(HD11),采用实时荧光定量PCR技术,对HD11细胞感染后不同时间点上的感染毒株的病毒载量进行测定。结果显示:在感染后至24 h期间,三个实验毒株在HD11细胞中都呈现出病毒载量持续上升;感染后242 h期间,强毒株在HD11细胞中的病毒载量仍呈现出持续上升状态,而两株弱毒株的载量却一直保持着相对稳定的状态,且在感染24 h之后,二者的载量与强毒株相比呈现出越来越显著差异状态。为阐明产生这一现象的原因,本研究进一步对HD11细胞内M1型、M2型巨噬细胞极化标志基因、TLR7及I型干扰素(IFN-α、β)的m RNA水平进行了测定。结果表明,强毒株感染后,HD11细胞呈现出剧烈的M1型及M2型混合极化特征,产生大量IFN-α、IFN-β,进而抑制了TLR7表达;而弱毒株感染后,仅呈现出轻微的单一极化型特征及I型干扰素变化,因而尚不足以明显影响TLR7的m RNA水平。此外,为进一步探究病毒的复制及其核酸对鸡巨噬细胞的影响,本研究还采用紫外照射2 h的方法对病毒进行灭活处理,并以此灭活病毒接种HD11细胞后再作检测。实验结果表明:HD11细胞在用紫外灭活的class I型弱毒株刺激后,其M1和M2的标志基因水平均较对照组有显著上调,并呈现出了与强毒株感染后相似的变化与变化趋势;而同样灭活后的强毒株和class II型弱毒株则并无明显影响。由此推测,class I型NDV可能具有某种尚未知的作用机制,此有待于今后的进一步探究。***7对NDV感染后鸡巨噬细胞功能作用的影响及其抗病毒机制的研究为进一步探究TLR7在NDV感染鸡巨噬细胞中的作用,本研究预先用TLR7特异性配体Loxoribine激活HD11细胞内的TLR7,然后再用NDV感染TLR7激活后的HD11细胞。实验结果表明,TLR7的激活能够显著降低NDV强毒株感染后HD11细胞内病毒载量,抑制了HD11细胞M1、M2混合极化趋势,并降低细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量;而TLR7的激活仅使class II型弱毒株感染后的

关键词：新城疫病毒鸡巨噬细胞病毒载量极化分型 TLR7

A1类清道夫受体在脂肪棕色化中的作用及其机制研究

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A1类清道夫受体在脂肪棕色化中的作用及其机制研究

作者：李金杰南京医科大学

学位级别：硕士

目的:研究表明,慢性寒冷刺激诱导下,M2型巨噬细胞在皮下白色脂肪组织中大量积聚,并促进米色脂肪细胞的活化和产热。A1类清道夫受体(SR-A1)是一种巨噬细胞表面的模式识别受体,可以介导巨噬细胞中脂质的积累及巨噬细胞的极化分型等功能。... 详细信息

目的:研究表明,慢性寒冷刺激诱导下,M2型巨噬细胞在皮下白色脂肪组织中大量积聚,并促进米色脂肪细胞的活化和产热。A1类清道夫受体(SR-A1)是一种巨噬细胞表面的模式识别受体,可以介导巨噬细胞中脂质的积累及巨噬细胞的极化分型等功能。研究表明,SR-A1在先天免疫、细胞凋亡和增殖中起关键作用。本课题组前期研究发现,SR-A1能够促进血管重构中和肥胖附睾脂肪组织中的巨噬细胞向M2型分化,因此具有拮抗炎症反应的作用。上述结果提示,SR-A1也可能在脂肪棕色化进程中发挥调控作用。为此,本课题拟针对SR-A1在脂肪棕色化进程中的作用及其机制开展深入研究。本研究对于发现新的肥胖相关性疾病干预靶点具有重要意义。方法:选取8周龄雄性SR-A1+/+(WT)小鼠和SR-A1-/-(KO)小鼠进行正常饮食下的30℃或6℃的刺激,刺激时间分别为1天、14天和30天。同时给予5-6周龄雄性WT小鼠和KO小鼠喂养正常饮食(CD)和高脂饮食(HFD)16周后,分别在30℃或6℃条件下刺激7天。在小鼠造模过程中,同步监测小鼠的体重变化,并在高脂饮食16周后进行小鼠代谢笼检测,检测小鼠基础代谢水平。造模结束后,收取小鼠皮下白色脂肪组织(ScWAT)和棕色脂肪组织(BAT),应用实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学的实验方法,检测表征脂肪棕色化作用和程度的指标(UCP1、Cidea、Cox8b)。同时,收取造模小鼠血清,试剂盒方法检测甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)的表达量,ELISA试剂盒方法检测瘦素(leptin)和脂联素(adiponectin)的表达量。为了探究SR-A1在脂肪棕色化中的作用机制,我们进一步检测脂肪组织中巨噬细胞的表达以及M1型、M2型巨噬细胞的极化分型情况;我们提取小鼠皮下白色脂肪组织中基质血管成分(SVF),通过流式细胞术检测其中巨噬细胞的数量以及M1型、M2型巨噬细胞的比例。最后,体外提取3-4周龄WT小鼠皮下白色脂肪组织中前脂肪细胞,诱导分化为成熟脂肪细胞,同时用WT或KO小鼠腹腔巨噬细胞培养上清进行诱导分化,给予寒冷刺激1小时,随后检测成熟脂肪细胞的棕色化程度。结果:正常饮食的WT小鼠和KO小鼠,分别置于30℃或6℃刺激1天,检测发现WT和KO小鼠脂肪棕色化程度没有明显的差异。随后,我们延长刺激时间至14天和30天,结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO 6℃小鼠皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织的棕色化程度(UCP1、Cidea、Cox8b等表达量)明显降低;寒冷刺激后,WT小鼠皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织中SR-A1表达量明显升高。同时,免疫组织化学结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO 6℃小鼠皮下白色脂肪组织中UCP1蛋白表达量明显降低。说明SR-A1缺失后,给予寒冷刺激后,脂肪棕色化程度明显降低,SR-A1在寒冷刺激下小鼠脂肪棕色化进程中起到了促进和保护作用。接下来我们建立了小鼠高脂饮食16周并给予寒冷刺激7天的模型,体重监测结果显示,与WTHFD小鼠相比较,KO HFD小鼠体重明显增加。代谢笼检测证明,高脂饮食后,与WTHFD小鼠相比较,KO HFD小鼠的耗氧量、产热量明显降低,二氧化碳呼出量降低,呼吸频率并无明显差异,以上结果说明高脂饮食之后,KO小鼠的基础代谢水平明显降低,同时这与小鼠饮食摄入、饮水摄入以及累积移动路程之间并无直接关系。同时发现给予寒冷刺激后,小鼠体重明显降低,与WT HFD小鼠相比较,寒冷刺激下KO HFD小鼠体重下降比率明显减少。进一步检测脂肪组织的棕色化程度,结果发现,KO HFD寒冷刺激小鼠皮下白色脂肪组织和棕色脂肪组织的棕色化程度(UCP1、Cidea、Cox8b等表达量)相比于WT HFD小鼠明显降低。免疫组织化学结果显示,寒冷刺激下,KO HFD小鼠皮下白色脂肪组织中UCP1蛋白表达量亦明显降低。检测造模小鼠血清相关指标(TG、TCH、Leptin、Adiponectin)表达量,结果发现,寒冷刺激下,与WTHFD小鼠相比较,KO HFD小鼠血清中脂联素表达量降低,而甘油三酯、总胆固醇和瘦素的表达量没有明显差异。应用高脂饮食诱导的肥胖小鼠的寒冷刺激模型,进一步确认了 SR-A1在寒冷刺激下小鼠脂肪棕色化进程中起到了促进和保护作用。我们进一步探究寒冷刺激下脂肪组织中巨噬细胞数量的变化对于脂肪棕色化的作用。检测正常饮食小鼠寒冷刺激30天后小鼠脂肪组织中巨噬细胞,结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO 6℃小鼠皮下白色脂肪组织中巨噬细胞(CD68、F4/80表达量)数量明显增加,其中M1型巨噬细胞(IL-6、TNF-α表达量)数量明显增加,而M2型巨噬细胞(Mgl表达量)数量明显降低。同时我们利用流式细胞术对正常饮食小鼠寒冷刺激30天后进行检测,结果显示,与WT 6℃小鼠相比较,KO

关键词： A1类清道夫受体寒冷刺激脂肪棕色化巨噬细胞极化分型脂肪细胞

基于细胞异质性的豆甾醇对主动脉细胞泡沫化的影响及机制研究

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基于细胞异质性的豆甾醇对主动脉细胞泡沫化的影响及机制研究

作者：肖凡浙江大学

学位级别：硕士

随着社会经济的发展和生活方式的改变,我国以动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）为代表的心血管病发病人口持续增加,AS是由脂质堆积驱动的在动脉壁出现斑块沉积为特征的慢性炎症过程,泡沫细胞的生成是AS疾病进展的关键,其中巨噬细胞和... 详细信息

随着社会经济的发展和生活方式的改变,我国以动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）为代表的心血管病发病人口持续增加,AS是由脂质堆积驱动的在动脉壁出现斑块沉积为特征的慢性炎症过程,泡沫细胞的生成是AS疾病进展的关键,其中巨噬细胞和平滑肌细胞（Smooth muscle cell,SMC）是泡沫细胞的重要组成,并且具有高度的可塑性和异质性,因此从单细胞的层面评估泡沫细胞的表型和功能变化对了解AS进程至关重要。植物甾醇（Phytosterol,PS）是一种具备较好的抗炎功效和调节脂质代谢功能的食品成分。豆甾醇是膳食中常见的植物甾醇,已有研究报道豆甾醇对AS的改善作用,但国内外关于其对AS的影响尚未得到一致结论,豆甾醇对泡沫细胞两大重要来源的巨噬细胞和平滑肌细胞的影响更缺少探究。为明确豆甾醇对细胞泡沫化的作用及机制,本课题以豆甾醇为研究对象,结合ApoE小鼠、氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱导的泡沫细胞模型,综合利用单细胞RNA测序（Single cell RNA sequencing,scRNA-seq）、流式细胞术、免疫荧光、蛋白印记等研究手段,解析豆甾醇对细胞泡沫化的影响,并通过探究其对泡沫细胞的脂质代谢、炎症反应、极化分型来揭示豆甾醇影响细胞泡沫化的机制。主要研究内容及结果如下:（1）对ApoE小鼠主动脉进行scRNA-seq,解析PS混合物对泡沫细胞异质性的影响。对巨噬细胞的亚群分析发现,炎性巨噬细胞在巨噬细胞亚群中占比最大且NF-κB信号通路在该细胞中富集,PS摄入减少了炎性巨噬细胞比例,并抑制了NF-κB信号通路相关基因的表达。通过对平滑肌细胞的亚群分析,鉴定出了一类SMC衍生的中间细胞（SMC-derived intermediate cells,SEM）,它在SMC亚群中占比最大,并具有分化成巨噬细胞样和纤维软骨细胞样细胞的潜能。PS降低了SEM的比例,抑制了该亚群中与细胞分化相关的基因表达,表明PS可以抑制SMC分化为巨噬细胞样和纤维软骨细胞样细胞,从而有助于斑块的稳定性。（2）利用RAW264.7细胞建立巨噬细胞泡沫化模型,探究豆甾醇对巨噬细胞泡沫化的影响,并分析其影响泡沫化的调控机制。首先,根据细胞存活率和油红O染色,将ox-LDL的造模浓度确定为90μM,发现豆甾醇显著减少了巨噬细胞泡沫化。对巨噬细胞脂质代谢的研究发现豆甾醇显著减少了脂质的累积,并且抑制了ox-LDL流入细胞,促进了胆固醇的流出。对巨噬细胞表面蛋白的测定发现,豆甾醇抑制了ox-LDL诱导的CD86炎性巨噬细胞极化,具体表现为抑制了RAW264.7细胞表面CD86受体的表达,降低了促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。结合scRNA-seq的结果,选择NF-κB通路对巨噬细胞极化的机制进行探究,结果显示,AMPK是关键的信号靶点,豆甾醇能够激活AMPK的磷酸化,抑制下游的NF-κB/NLRP3信号通路,从而减缓巨噬细胞向促炎细胞亚型的分化。（3）利用A7r5细胞建立平滑肌细胞泡沫化模型,探究豆甾醇对平滑肌细胞泡沫化的影响。根据细胞存活率和油红O染色将ox-LDL的造模浓度确定为50μM。在该模型上,豆甾醇显著减少了细胞泡沫化。对脂质代谢调控的研究发现,豆甾醇对ox-LDL流入A7r5细胞没有显著的抑制作用,但是促进了NBD胆固醇的外流,验证了豆甾醇对平滑肌细胞脂质积累的抑制作用主要是通过促进胆固醇的逆转运实现的。对细胞表型的研究发现,豆甾醇减缓了A7r5细胞表面CD68受体的表达,从而抑制了ox-LDL诱导的平滑肌细胞向巨噬细胞的表型转变。（4）构建ApoE小鼠AS模型,结合豆甾醇对小鼠主动脉泡沫细胞的影响对细胞实验的结果进一步验证。研究表明,豆甾醇减少了斑块中泡沫细胞的数量且降低了斑块面积,说明对泡沫细胞的形成具有抑制作用。对巨噬细胞亚型的研究发现,豆甾醇能够抑制主动脉中CD86炎性巨噬细胞,并促进CD163抗炎巨噬细胞极化,结合血清中炎症因子表达水平,说明植物甾醇在调节巨噬细胞亚型上发挥了抗炎作用。对平滑肌细胞亚型的研究发现,豆甾醇减少了主动脉F4/80α-SMA细胞的比例,说明豆甾醇缓解了平滑肌细胞泡沫化过程中向巨噬细胞亚型的表型转变。对通路的研究发现,与模型组小鼠相比,豆甾醇组小鼠主动脉的NF-κB/NLRP3通路得到了显著抑制,与体外实验结论一致,说明该通路是豆甾醇调控细胞泡沫化的重要途径。综上所述,本课题首先利用scRNA-seq揭示了植物甾醇混合物对ApoE模型小鼠泡沫细胞亚型组成比例和基因表达的积极调控。随后选取豆甾醇,探究其对泡沫细胞两大重要来源巨噬细胞和平滑肌细胞的脂质代谢和表型调节的影响,最后利用ApoE小鼠的动

关键词：豆甾醇动脉粥样硬化炎症极化分型巨噬细胞平滑肌细胞

结核特异性多肽E6、E7和C14对单核-巨噬细胞亚型极化的影响

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中国医药生物技术 2016年第3期11卷 216-223页

作者：申东梅方毅敏申雁鸣刘国标姚亚男赖小敏中山大学中山医学院微生物学教研室热带病防治研究教育部重点实验室结核病防治研究所海洋微生物功能分子广东省高校重点实验室广东省重大传染病预防和控制技术中心广州510080 广州市胸科医院 510095

目的运用流式细胞术检测单核-巨噬细胞极化亚型M1(CD14^+CD16^+)及M2(CD14^+CD163^+),探讨结核特异性多肽对单核-巨噬细胞极化分型的影响。方法以3种结核特异性多肽E6、E7和C14作为刺激物,刺激人急性白血病单核细胞株(THP-1细胞)、结核... 详细信息

目的运用流式细胞术检测单核-巨噬细胞极化亚型M1(CD14^+CD16^+)及M2(CD14^+CD163^+),探讨结核特异性多肽对单核-巨噬细胞极化分型的影响。方法以3种结核特异性多肽E6、E7和C14作为刺激物,刺激人急性白血病单核细胞株(THP-1细胞)、结核病患者胸水单个核细胞及外周血单个核细胞(PBMC),用流式细胞术检测刺激物不同时间点对单核-巨噬细胞极化表面标记表达的影响。结果结核特异性多肽E6刺激THP-1 24+0 h、24+24 h、24+48 h、24+72 h后,CD16/CD163阳性率分别为16.85%/13.78%、19.59%/15.68%、18.14%/14.19%、13.61%/11.47%。E7刺激效果与E6相似,C14对THP-1的CD16/CD163表达影响不如前两种多肽强。结核特异性多肽E6刺激结核患者胸水或血标本单核细胞19 h后,CD14+CD16+阳性率(1#患者:1.66%,2#患者:4.37%)与CD14^+CD163^+阳性率(1#患者:1.76%,2#患者:2.82%)差异不大,但CD14^+CD16^+CD86^+阳性率(1#患者:2.20%,2#患者:6.16%)大于CD14^+CD163^+CD206^+阳性率(1#患者:1.37%,2#患者:0.92%)。E7刺激效果与E6相似,C14对结核患者胸水或血标本单核细胞CD14/CD16/CD163表达影响不如前两种多肽强。结论 3种结核特异性多肽特别是E6、E7体外刺激单核细胞株THP-1、结核患者胸水或血标本单核细胞主要向M1型单核-巨噬细胞极化。

关键词：肽类白血病,单核细胞,急性单核-巨噬细胞系统极化分型