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板栗疫病菌中一个依赖于经典分泌途径的无信号肽分泌蛋白的鉴定

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基因组学与应用生物学 2016年第11期35卷 3034-3039页

作者：罗德朋蓝颖王金子陈保善广西大学生命科学与技术学院南宁530004 广西大学农学院南宁530004 亚热带生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004

依赖于内质网/高尔基体的经典分泌途径是胞外分泌的主要途径。传统上认为,经典分泌途径所分泌的蛋白,通常都具有信号肽和高尔基体定位信息。经典分泌途径分泌蛋白由内质网向高尔基体运输,需要COPI小泡作为载体,而布雷非德菌素A(BFA)可... 详细信息

依赖于内质网/高尔基体的经典分泌途径是胞外分泌的主要途径。传统上认为,经典分泌途径所分泌的蛋白,通常都具有信号肽和高尔基体定位信息。经典分泌途径分泌蛋白由内质网向高尔基体运输,需要COPI小泡作为载体,而布雷非德菌素A(BFA)可以抑制COPI被膜小泡的形成,最终阻断分泌蛋白由内质网向高尔基体的运输。为建立一个简便的鉴别经典分泌途径分泌蛋白的方法,本研究从板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)分泌蛋白组数据库中选择一个不具有信号肽、跨膜区和高尔基体定位信息的氧化还原酶(POR),通过构建POR-GFP融合蛋白,观察其在野生型菌株和在受BFA处理菌株中的细胞定位,发现该融合蛋白的细胞内分布在野生型菌株呈弥散型分布,而在BFA处理菌株时呈聚集型分布,表明其在细胞内由内质网到高尔基体的运输受到了抑制。该结果表明,POR的分泌依赖于经典分泌途径,属于经典途径分泌蛋白。因此,GFP融合蛋白结合BFA处理可以准确鉴定经典途径分泌蛋白。

关键词：经典分泌途径板栗疫病菌氧化还原酶 BFA

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板栗疫病菌RasGAP基因的功能研究

基因组学与应用生物学 2019年第10期38卷 4504-4512页

作者：李洋林榆淞李永兵陈保善李茹广西大学生命科学与技术学院南宁530004 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004

Ras超家族蛋白的生化功能是催化GTP的水解,为生命体提供能量。RasGAP是Ras蛋白激活子,可提高Ras蛋白对GTP的水解能力。本研究利用同源双交换的方法成功构建了板栗疫病菌RasGAP基因的缺失突变株ΔRasGAP。与野生型菌株EP155及敲除出发菌... 详细信息

Ras超家族蛋白的生化功能是催化GTP的水解,为生命体提供能量。RasGAP是Ras蛋白激活子,可提高Ras蛋白对GTP的水解能力。本研究利用同源双交换的方法成功构建了板栗疫病菌RasGAP基因的缺失突变株ΔRasGAP。与野生型菌株EP155及敲除出发菌株Δcpku80相比,ΔRasGAP突变体的菌丝形态、漆酶分泌、致病力和对低毒病毒复制的支持均无明显变化。但ΔRasGAP的生长速度加快,色素分泌延迟,分生孢子产量也显著下降。mRNA定量分析表明,RasGAP基因的缺失导致产孢相关基因的转录模式发生明显改变,提示RasGAP是板栗疫病菌分生孢子形成的一个重要调控因子。本研究为揭示板栗疫病菌产孢机制提供了新的知识。

关键词：板栗疫病菌 RasGAP 基因产孢产色素

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板栗疫病菌cpnat基因的功能分析

基因组学与应用生物学 2021年第2期40卷 649-655页

作者：林榆淞赵丽九常佳妮李茹陈保善广西大学生命科学与技术学院南宁530004 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004 广西大学农学院南宁530004

赖氨酸乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,广泛参与多种生命过程的调节。目前,赖氨酸乙酰化修饰在植物病原真菌——板栗疫病菌中的功能和调节机制尚无报道。本研究克隆了板栗疫病菌的编码乙酰转移酶的cpnat基因,成功构建了cpnat基因... 详细信息

赖氨酸乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,广泛参与多种生命过程的调节。目前,赖氨酸乙酰化修饰在植物病原真菌——板栗疫病菌中的功能和调节机制尚无报道。本研究克隆了板栗疫病菌的编码乙酰转移酶的cpnat基因,成功构建了cpnat基因的缺失突变体△cpnat,与野生型菌株相比,板栗疫病菌cpnat基因缺失株生长速率不变,气生菌丝变浓密,菌丝末端分支变多,色素明显减少,产孢能力显著降低,致病力也降低。cpnat基因的缺失并不影响参与信号传导途径的cpga1、cpgb1、cpmk1、cpmk2和ste12基因的转录水平,表明其对色素、产孢和致病力的调控是通过尚未被发现的途径实现的。本研究结果为揭示乙酰化修饰在病原真菌中的功能提供了新的知识。

关键词：板栗疫病菌乙酰化 cpnat基因产孢致病力

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板栗疫病菌cpomt基因的功能

基因组学与应用生物学 2017年第1期36卷 305-310页

作者：李林生周思思姚颜萍廖素环陈保善李茹广西大学生命科学与技术学院南宁530004 广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004

板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的一种丝状子囊菌。UV57是一个不支持病毒复制且致病力丧失的***紫外诱变突变株。前期蛋白质组研究结果显示,蛋白86233(一种甲基转移酶)只在UV57中出现,而在野生型对照株EP155中没... 详细信息

板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的一种丝状子囊菌。UV57是一个不支持病毒复制且致病力丧失的***紫外诱变突变株。前期蛋白质组研究结果显示,蛋白86233(一种甲基转移酶)只在UV57中出现,而在野生型对照株EP155中没有检测到。为研究编码86233蛋白的cpomt基因的功能,本研究通过同源重组方法成功构建了缺失突变体Δcpomt及其互补转化株。与野生型EP155相比,Δcpomt菌株生长缓慢,色素分泌减少,产孢量降低,菌丝形态异常,对休眠板栗树枝的致病性显著降低。而在互补转化株Δcpomt-com中,这些表型及致病力变化均可以恢复到野生型水平。cpomt基因的缺失对低毒病毒CHV1-EP713的复制累积量没有影响,但导致抗逆相关基因G-α,产孢基因CLS-32,色素合成酶基因PKS转录水平明显下调。本研究为阐明甲基转移酶在病原真菌中的作用提供了新的知识。

关键词：板栗疫病菌 cpomt基因甲基转移酶致病力

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板栗疫病菌致病力分化的研究

微生物学报 1995年第6期35卷 470-473页

作者：文新陈育新梁棉勇刘伟钊梧州动植物检疫局梧州543002 广西农业大学植保系南宁530005

中国板栗(Castanea mollissima Blume)对板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica(Murr.)Barr)具有强的抗病力。但近十多年来,我国许多省份均发现有板栗疫病,据调查,广西有19个县市存在栗疫病,有的地方发病还相当严重。为了解释疫病发生的... 详细信息

中国板栗(Castanea mollissima Blume)对板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica(Murr.)Barr)具有强的抗病力。但近十多年来,我国许多省份均发现有板栗疫病,据调查,广西有19个县市存在栗疫病,有的地方发病还相当严重。为了解释疫病发生的上述情况,并为生产和该病菌的更深入研究提供指导,作者在广西桂林、南宁、柳州、梧州、河池等地收集菌株,对疫病菌致病性的分化进行了研究,现将结果报道如下。 1 材料和方法 1.1 毒力参照菌株法国已知弱毒株EPF为毒力参照株。 1.2 栗疫病菌的采集、分离和单孢纯化 1.2.1 标本采集:1988年12月～1989年6月,采自广西桂林、南宁、柳州、梧州、河池等地板栗病株。 1.2.2 菌株分离和纯化:将病枝或病树皮,用经灯焰灼烧过的刀片削去表皮,取坏死内皮约5×5mm^2,压于PDA上,28℃,光照培养,产孢后用微块法进行单孢纯化。 1.3

关键词：板栗疫病菌致病力分化板栗疫病

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板栗疫病菌致病性机理的双向凝胶电泳法研究

广西植物 2008年第1期28卷 117-120页

作者：姜明国何小丹裴氏秋河江欢欢黄永颜陈保善广西大学生命科学与技术学院

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台。如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图谱是进行后续研究的关键。为探索适用于板栗疫病菌可溶性总蛋白的最佳提取条件，从蛋白组学角度来探索板栗疫病菌致病性机理，比较了目前在丝状... 详细信息

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台。如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图谱是进行后续研究的关键。为探索适用于板栗疫病菌可溶性总蛋白的最佳提取条件，从蛋白组学角度来探索板栗疫病菌致病性机理，比较了目前在丝状真菌中常用的两种蛋白质提取方法，制备的蛋白质样品经双向凝胶电泳后，在凝胶上呈现的蛋白质斑点的丰度和分布特点。结果表明，两种方法获得的蛋白质主要集中分布在pH4～7的范围内；TCA-丙酮沉淀法得到的图谱分辨率高但是蛋白质总量很少。裂解液-TCA-丙酮沉淀法得到的蛋白质总量较大，通过cleanupkit处理后图谱分辨率可以达到差异蛋白组的要求。随机提取几个银染蛋白点用MALDI-TOFMS／MS进行分析，可以得到高质量的肽质量指纹谱。表明该样品制备方法可以满足蛋白质鉴定的要求。

关键词：蛋白质提取双向凝胶电泳蛋白质组板栗疫病菌

板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光蛋白共定位载体的构建

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基因组学与应用生物学 2011年第3期30卷 308-315页

作者：杨峰施李鸣范素华谭俊谢涛商巾杰陈保善广西大学生命科学与技术学院南宁530004 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室南宁530004 微生物及植物遗传工程教育部重点实验室南宁530005

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿... 详细信息

低毒病毒-板栗疫病菌组合是研究病毒与宿主相互作用的一个优秀的模式系统。我们构建了含绿色荧光蛋白基因gfp的载体pCPXHY2GFP与含红色荧光蛋白基因rfp的载体pCPXG418RFP,并用于转化野生型菌株EP155,获得了以潮霉素为筛选标记、表达绿色荧光蛋白的转化株pCPXHY2GFP/EP155和以G418为筛选标记、表达红色荧光蛋白的转化株pCPXG418RFP/EP155。将载体pCPXG418RFP转化pCPXHY2GFP/EP155,获得的转化株能观察到绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白共定位的现象。板栗疫病菌绿色荧光与红色荧光共定位载体pCPXHY2GFP与pCPXG418RFP的构建,为深入研究病毒与宿主相互作用的分子机制提供了强有力的研究材料。

关键词：板栗疫病菌绿色荧光蛋白红色荧光蛋白共定位载体构建

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板栗疫病菌ntl基因的功能研究

基因组学与应用生物学 2013年第4期32卷 420-427页

作者：李茹李洋李林生廖素环白凌云陈保善广西大学生命科学与技术学院南宁530004 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530004

板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的病原真菌。在实验室前期研究中,获得了一个不支持病毒复制且丧失致病力的板栗疫病菌紫外诱变突变株UV57。与野生型菌株EP155相比,UV57中检测不到蛋白100472的表达。为研究蛋白100... 详细信息

板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的病原真菌。在实验室前期研究中,获得了一个不支持病毒复制且丧失致病力的板栗疫病菌紫外诱变突变株UV57。与野生型菌株EP155相比,UV57中检测不到蛋白100472的表达。为研究蛋白100472的功能,我们构建了编码100472蛋白的ntl基因的缺失突变体Δntl及其互补转化株Δntl-com。与野生型EP155相比,Δntl菌株表型不变,但对休眠板栗树枝的致病性明显降低,而互补转化株Δntl-com的致病力与野生型没有区别。ntl基因的缺失不影响低毒病毒CHV1-EP713的复制累积量,但导致参与G蛋白信号传导途径的cpga1、cpgb1、cpgc1和ste12基因以及参与MAPK途径的cpmk1转录水平明显下调。本研究结果为阐明病原真菌致病机制提供了新的知识。

关键词：板栗疫病菌 ntl基因低毒病毒致病力

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板栗疫病菌的分子检测研究

板栗疫病菌的分子检测研究

作者：麻文建四川农业大学

学位级别：硕士

板栗疫病又称板栗溃疡病,是由寄生隐丛赤壳菌引起的一种枝干性病害。近年来,该病在一些地方的发病率呈上升趋势,特别是四川自2002年开始发生以来几乎毁灭所有板栗,目前已经成为板栗生产业健康发展的重要限制因素。板栗疫病菌属于森林有... 详细信息

板栗疫病又称板栗溃疡病,是由寄生隐丛赤壳菌引起的一种枝干性病害。近年来,该病在一些地方的发病率呈上升趋势,特别是四川自2002年开始发生以来几乎毁灭所有板栗,目前已经成为板栗生产业健康发展的重要限制因素。板栗疫病菌属于森林有害生物检疫对象之一,因此,开展对板栗疫病菌病原分子检测对控制该病流行和防治具有重要意义。本研究针对传统方法对板栗疫病发病早期症状难以识别、病原菌鉴定困难等问题,对板栗疫病菌的分子检测开展了相关的研究。以不同来源地的板栗疫病菌和其它真菌分离物为研究材料,根据板栗疫病菌的ITS序列特征设计特异性引物,建立板栗疫病菌的ITS-PCR分子检测技术。利用RAPD技术筛选出了板栗疫病菌的特异RAPD片段,并对该片段进行克隆、测序、设计SCAR引物,通过PCR扩增,成功将板栗疫病菌的RAPD特异片段转化为更稳定的SCAR标记。将两对引物进行组合并优化PCR反应条件,建立了板栗疫病菌的双重PCR检测方法。研究的主要结果如下:1.根据板栗疫病菌与其它真菌的ITS序列比对结果,利用Primer 6.0软件设计出板栗疫病菌的特异引物:CP1(5’-CGGCCCACTAAACTCTTTGT-3’)/CP2(5’-ATTTCAGGGCCTACCGTTTT-3’)。PCR扩增结果表明,引物CP1/CP2能在板栗疫病菌为模板DNA的PCR反应体系中扩增得到285 bp的特异条带,而其它供试菌株和阴性对照均无此条带。2.利用正交试验对影响RAPD-PCR反应体系的各种因素进行研究,建立了适合供试菌株的最佳RAPD反应体系。在25μL的反应体系中:模板DNA 40 ng,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)1 U、Mg2+(25 mmol/μL)2.0 μL、dNTP(2.5 mmol/μL)2.5 μL、引物(10 mmol/μL)1.0 μL,10×PCRbuffer2.5 μL,加 ddH20 补足 25 μL。扩增程序:94℃预变性 4 min;94℃变性 30 s,37℃退火 40 s,72℃延伸 70 s,40 个循环;72℃延伸 10 min。3.利用优化后的RAPD反应体系筛选出了能特异扩增板栗疫病菌基因组DNA的随机引物S160(5’-AACGGTGACC-3’)及其扩增的特异RAPD片段,对特异RAPD片段进行切胶、回收、克隆和测序后,获得大小为389 bp的特异片段。4.根据板栗疫病菌特异RAPD片段测序结果,利用软件Primer 6.0设计了一对SCAR 标记引物:SC1(5’-AACGGTGACCCTTCTGGGGC-3’)/SC2(5’-AACGGTGACCGCAAAGGACTC-3’)。PCR验证结果表明该引物对能从板栗疫病菌中特异性地扩增出389 bp的条带,证明成功实现了 RAPD标记向SCAR标记的转化。5.将引物CP1/CP2和SC1/SC2组合为双重PCR引物并正交优化PCR反应条件,以此为基础建立了板栗疫病菌的双重PCR分子检测体系。双重PCR能在板栗疫病菌的DNA中扩增特异性的扩增到285 bp和389 bp的双条带,其它供试菌株和阴性对照无条带产生,灵敏度检测结果显示300 fg/μL的基因组DNA是该体系的检测限。6.通过对自然发病植株的验证,上述建立的双重PCR检测方法能准确地检测到具有典型症状、发病初期和处于潜伏期病害的板栗枝干组织中的板栗疫病菌。本研究所采用的双重PCR是一种快速、准确有效的检测技术,可以用于板栗疫病的早期诊断和病原鉴定。

关键词：板栗疫病菌 ITS RAPD SCAR 双重PCR 分子检测