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中国畜牧兽医 2023年第8期50卷 3123-3132页

作者：赵德辉马翠柳吴炎刘可园张博睿张海华刘晗璐河北科技师范学院动物科技学院河北省特色动物种质资源挖掘与创新重点实验室秦皇岛066004 赤峰学院农学院赤峰024000 中国农业科学院特产研究所长春130112 蒙东农业生态保护与动植物资源开发利用重点实验室赤峰024000

【目的】研究饲粮中添加杰丁塞伯林德纳氏酵母对育成期乌苏里貉营养物质消化率、氮代谢、血清生化指标及粪便真菌菌群组成的影响。【方法】选取健康的(65±5)日龄体重相近雄性乌苏里貉45只,随机分成3组,每组15只,对照组(N组)饲喂基础饲... 详细信息

【目的】研究饲粮中添加杰丁塞伯林德纳氏酵母对育成期乌苏里貉营养物质消化率、氮代谢、血清生化指标及粪便真菌菌群组成的影响。【方法】选取健康的(65±5)日龄体重相近雄性乌苏里貉45只,随机分成3组,每组15只,对照组(N组)饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮中添加低(L组)和高剂量(H组)杰丁塞伯林德纳氏酵母菌,分别为每天每只2和10 mL(1×10^(9)CFU/mL)。预试期7 d,正试期30 d。于正试期最后3 d采集粪便和饲粮样品,测定各营养物质表观消化率;试验结束当天晨饲前采集血液,晨饲后采集新鲜粪便,测定血清生化指标和粪便真菌菌群组成。【结果】与N组相比,①L组乌苏里貉粗脂肪和粗蛋白质消化率显著提高(P杰丁塞伯林德纳氏酵母可提高育成期乌苏里貉的营养物质消化率、氮代谢,降低粪便有害真菌的相对丰度,综合考虑,其适宜的添加量为每天每只2 mL(1×10^(9)CFU/mL)。

关键词：杰丁塞伯林德纳氏酵母乌苏里貉营养物质消化率氮代谢真菌菌群结构

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杰丁塞伯林德纳氏酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统开发及其在异源甾醇生产菌株改造中的应用

杰丁塞伯林德纳氏酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统开发及其在异源甾...

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作者：顾丽杉长春工业大学

学位级别：硕士

杰丁塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera jadinii·CJ)是美国食品和药物管理局(FDA)认证的GRAS安全菌种,已在食品和饲料行业使用了近一个世纪,是重要的工业生产酵母。杰丁塞伯林德纳氏酵母属于Crabtree-阴性酵母,具有强大的呼吸能力,生长快... 详细信息

杰丁塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera jadinii·CJ)是美国食品和药物管理局(FDA)认证的GRAS安全菌种,已在食品和饲料行业使用了近一个世纪,是重要的工业生产酵母。杰丁塞伯林德纳氏酵母属于Crabtree-阴性酵母,具有强大的呼吸能力,生长快速,因此常被用来生产蛋白(单细胞蛋白,各种工业酶)以及一些高附加值天然产物(如β-葡聚糖,生物素,类胡萝卜素等)。由于杰丁塞伯林德纳氏酵母属于四倍体酵母,应用传统的遗传操作工具对其进行遗传改造需要四轮操作才能完成,费时费力。因此有必要开发更为简单高效的遗传操作工具,使该酵母的工业应用潜能进一步得到释放。CRISPR/Cas9基因编辑系统是高效的基因编辑工具,具有编辑效率高,可同时编辑多个等位基因,以及无痕编辑等特点。该技术经过近些年的发展,已广泛应用于各种非常规酵母的遗传改造。由于CRISPR/Cas9基因编辑系统还没在杰丁塞伯林德纳氏酵母中建立,本课题着重开展了相关开发工作。本课题首先设计并构建了可应用于杰丁塞伯林德纳氏酵母CICC#1769菌株基因编辑的一元CRISPR/Cas9质粒pCJ-Cas9-sgRNA-G418。该质粒由六个独立模块组成,包括(M1)含有噬菌体f1的DNA复制原点(f1 ori)的模块;(M2)G418抗性筛选标记模块;(M3)杰丁塞伯林德纳氏酵母自主复制序列(ARS)模块;(M4)用内源tRNA(UGG反密码子)启动子驱动的单向导RNA(SgRNA)表达模块;(M5)质粒复制起点(ori)和氨苄青霉素抗性筛选标记模块;(M6)用内源核苷二磷酸还原酶Cj RNR2启动子驱动的化脓性链球菌Sp Cas9基因表达模块。用该质粒敲除CICC#1769菌株中的磷酸核糖氨基咪唑羧甲基化酶编码基因ADE2,发现一次转化同时敲除掉四个ADE2等位基因的效率可达85%。为进一步提升基因编辑效率,本课题随后对pCJ-Cas9-sgRNA-G418质粒中的一些关键元件进行优化:(1)通过测试不同长度和来源的自主复制序列,发现分离自杰丁塞伯林德纳氏酵母核染色体上的1.9Kb长度的ARS1对维持质粒的稳定性效果最好。(2)通过测试不同内源tRNA启动子驱动表达sgRNA的能力,发现不同tRNA启动子具有相似的基因编辑效率。(3)发现用THD3(编码糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶)组成型强启动子驱动Sp Cas9核酸表达可显著提升基因编辑效率至100%。最终整合优化元件的质粒被命名为pCJ-Cas9-sgRNA-G418-II。本课题其次测试了基因组杂合位点对基因编辑效率的影响。借助2%w/v葡萄糖生长条件下的RNA-seq转录组数据,本课题发现CICC#1769菌株核基因组呈现“AAAB”核型并存在大量杂合位点。本课题通过在ADE2基因中选择特殊位置的20 nt间隔序列(spacer)S1和S2,分别测试了间隔序列中含有1个或2个单核苷酸突变(SNV)对基因编辑的影响。结果发现,CRISPR/Cas9系统对仅含有一个SNV的位点的包容性较好,编辑效率依然可达100%;但无法对含有2个SNV的位点进行编辑。考虑到G418筛选成本较高,本课题进一步在CICC#1769菌株中构建了营养缺陷型筛选体系。通过pCJ-Cas9-sgRNA-G418-II质粒敲除URA3基因,获得了四个等位基因缺失的纯合突变体ΔURA3。将URA3表达盒替换G418表达盒,最终构建成了可用于尿嘧啶营养缺陷筛选的质粒pCJ-Cas9-sgRNA-URA3。由于该质粒在YPD培养继代过程中可丢失,因此可以应用该质粒实现连续的基因编辑。微生物宿主实现异源高附加值生物制品生产需要借助代谢工程手段引入有单个或多个基因所组成的特定的生物合成途径,而精准的将这些异源生物合成途径插入到杰丁塞伯林德纳氏酵母的多倍体基因组中目前还存在挑战。为了验证本课题开发的CRISPR/Cas9系统在代谢工程改造中的应用效果,本课题选择了在CICC#1769菌株中异源合成代表性的植物甾醇“菜油甾醇”以及动物甾醇“胆固醇”作为案例,测试了将单一或多个基因表达盒经一次转化同时插入四个等位基因的相同位点的效率。本研究将土豆来源的甾醇7位脱氢酶StDWF5整合至酵母麦角固醇合成关键基因ERG5位点,实现了酵母从头合成菜油甾醇,整合效率为100%。对获得的菜油甾醇生产菌株CJ-Cam摇瓶发酵120 h后,菜油甾醇的产量达到92.1 mg/L。随后本课题尝试将土豆来源的甾醇7位脱氢酶StDWF5,原鸡来源的甾醇24位脱氢酶Gg DHCR24,以及内源的3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG1的基因过表达盒,同时插入到ERG5位点从而获得胆固醇从头合成菌株CJ-Cho。结果显示用1Kb同源臂进行同源重组组装时,阳性率可达62.5%。对CJ-Cho摇瓶发酵120 h后,胆固醇产量达到81.8 mg/L。进一步对CJ-Cho菌株的

关键词：杰丁塞伯林德纳氏酵母 CRISPR/Cas9 酵母甾醇从头合成菜油甾醇胆固醇

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杰丁塞伯林德纳氏酵母在乌苏里貉生产中的应用效果研究

杰丁塞伯林德纳氏酵母在乌苏里貉生产中的应用效果研究

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作者：赵德辉河北科技师范学院

学位级别：硕士

本研究以生长期(育成期和冬毛期)乌苏里貉为研究对象,通过饲喂添加不同水平杰丁塞伯林德纳氏酵母的饲粮,研究杰丁塞伯林德纳氏酵母对乌苏里貉生长性能、消化代谢、血清及肠道菌群等方面的影响,明确杰丁塞伯林德纳氏酵母在乌苏里貉生产... 详细信息

本研究以生长期(育成期和冬毛期)乌苏里貉为研究对象,通过饲喂添加不同水平杰丁塞伯林德纳氏酵母的饲粮,研究杰丁塞伯林德纳氏酵母对乌苏里貉生长性能、消化代谢、血清及肠道菌群等方面的影响,明确杰丁塞伯林德纳氏酵母在乌苏里貉生产中的应用效果,为乌苏里貉饲料中合理添加杰丁塞伯林德纳氏酵母提供理论基础与科学依据。试验一:杰丁塞伯林德纳氏酵母对育成期乌苏里貉生长性能、营养物质利用率、血液指标及肠道菌群的影响。45只60(±5)日龄雄性乌苏里貉随机分为3组,每组15只。对照组(N组)饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮中添加1 mL/只(L组)(1×10 CFU/mL)和5 mL/只(H组)(5×10 CFU/mL)的杰丁塞伯林德纳氏酵母菌液,预试期7d,正试期58 d。结果表明:与N组相比,L组和H组能够提高平均日增重,降低料重比(P氏菌属(Prevotella)的相对丰度(P氏菌属(Blautia)和Agathobacter的相对丰度(P杰丁塞伯林德纳氏酵母对冬毛期乌苏里貉生长性能、消化代谢、血清生化、免疫、抗氧化及肠道菌群的影响。45只135(±5)日龄雄性乌苏里貉随机分为3组,每组15只。试验设计同试验一,预试期7d,正试期30 d。结果表明:L组和H组能够提高平均日增重,降低料重比(P0.05);与N组相比,L组和H组显著降低血清葡萄糖水平(P氏菌属(Blautia)的相对丰度显著低于N组和L组(P氏菌属(Prevotella)、萨特氏菌属(Sutterella)和链型杆菌属(Catenibacterium)的相对丰度显著高于H组(P杰丁塞伯林德纳氏酵母能够提高生长期(育成期和冬毛期)乌苏里貉生长性能、血清免疫和抗氧化能力,提高育成期乌苏里貉氮代谢,但对冬毛期乌苏里貉营养物质消化率和氮代谢无显著影响;添加水平为1mL/只时,显著提高育成期乌苏里貉粗脂肪和粗蛋白质消化率;此外,饲粮中添加杰丁塞伯林德纳氏酵母能够改善生长期乌苏里貉肠道微生物,提高优势菌属的相对丰度,降低肠道有害菌属的相对丰度。其中,1mL/只是最有效的补充水平。因此,杰丁塞伯林德纳氏酵母具有作为乌苏里貉饲料中抗生素替代品的潜力。

关键词：杰丁塞伯林德纳氏酵母貉生长性能消化代谢免疫抗氧化肠道菌群

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