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中国农业科学 2021年第14期54卷 2952-2964页

作者：张硕智慧唐婵娟罗明昭汤沙贾冠清贾彦超刁现民中国农业科学院作物科学研究所湖北省农业科学院粮食作物研究所

【目的】谷子是C4模式植物,其叶色突变体是研究C4光合途径的良好材料。通过研究谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性并对突变基因进行定位,为克隆突变基因、解析谷子叶绿体合成及发育机理、进一步理解C4光合调控机制奠定基础。【方法】... 详细信息

【目的】谷子是C4模式植物,其叶色突变体是研究C4光合途径的良好材料。通过研究谷子条纹叶突变体A36-S的细胞学特性并对突变基因进行定位,为克隆突变基因、解析谷子叶绿体合成及发育机理、进一步理解C4光合调控机制奠定基础。【方法】谷子条纹叶突变体A36-S是由育种创制的中间材料A36自然变异而来。对比A36-S及其正常表型等基因系A36-N的表型特征,调查二者的株高、叶宽、叶长、穗重、千粒重、结实率等农艺性状指标;测定A36-S和A36-N的叶绿素含量、净光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度、蒸腾速率等光合指标,分析A36-S的光合特性;观察A36-S和对照品种豫谷1号的叶片半薄横截切片和超薄切片,分析A36-S叶片解剖结构特征,分别统计叶肉细胞和维管束鞘细胞中叶绿体的数量和面积,从而分析叶绿体合成及发育情况;构建A36-S×SSR41的F2分离群体,统计群体中正常表型单株与条纹叶单株的数量,进行遗传分析;分别构建F2分离群体正常单株与条纹叶单株的DNA混池,采用集团分离分析法(BSA法)进行突变基因的定位;筛选、开发多个SSR标记及In-Del标记,扫描F2群体中条纹叶单株,进行进一步基因定位。【结果】谷子条纹叶突变体A36-S在全生育期表现出叶片不规则白色条纹的表型。农艺性状分析表明,相比其近等基因系A36-N,A36-S在株高、叶宽、穗重、千粒重、结实率等表型上均显著下降。光合指标测定表明A36-S叶片中叶绿素含量明显降低,尤其是叶绿素b含量下降更为严重,同时净光合速率也明显下降。叶片解剖结构观察发现,与对照豫谷1号相比,A36-S的Kranz结构变化并不明显,但叶绿体数量和大小都显著低于对照。观察叶绿体超微结构,发现A36-S的不同细胞间叶绿体发育状况差异较大,依据叶绿体发育情况可将叶片细胞可分为3类:Ⅰ类细胞具有正常发育的叶绿体;Ⅱ类细胞叶绿体基粒及片层结构减少;Ⅲ类细胞则叶绿体结构严重异常甚至不含有叶绿体。遗传分析表明A36-S表型受隐性单基因控制,利用F2分离群体将突变基因定位在第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。【结论】谷子A36-S条纹叶突变体表现为农艺性状及光合能力下降,叶片细胞叶绿体的数量、大小及结构均表现出显著异常。条纹叶性状受隐性单基因控制,利用分子标记将候选基因定位于第4染色体7.66—27.90 Mb区间内。

关键词：谷子条纹叶突变体叶绿体基因定位

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水稻长护颖突变体和条纹叶突变体的基因鉴定与qRT-PCR表达分析

水稻长护颖突变体和条纹叶突变体的基因鉴定与qRT-PCR表达分析

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作者：朱玲四川农业大学

学位级别：硕士

第一部分水稻长护颖突变体的基因克隆与表达分析利用EMS对水稻(Oryza sativaL.)保持系品种宜香1B进行诱变,筛选出三份长护颖突变体Oslg-1, Oslg-2和Oslg-3,通过表型分析、等位性鉴定、基因定位和生物信息学分析,以及qRT-PCR表达分析,获... 详细信息

第一部分水稻长护颖突变体的基因克隆与表达分析利用EMS对水稻(Oryza sativaL.)保持系品种宜香1B进行诱变,筛选出三份长护颖突变体Oslg-1, Oslg-2和Oslg-3,通过表型分析、等位性鉴定、基因定位和生物信息学分析,以及qRT-PCR表达分析,获得如下结果：1. Oslg-1突变体小穗在幼穗发育早期与野生型无明显差异,但在成熟期其护颖的远轴表皮细胞凸起且粗糙,形成的结节轴向对齐排列,且毛状物较多,形成垂直相间的横纵沟,表皮细胞结构与外稃的极其相似。2.利用F2分离群体对突变体Oslg-1进行基因定位,遗传分析表明,Oslg-1受一对隐性单基因控制,将OsLG基因定位于第7染色体短臂SSR标记RM5344和RM20934之间,遗传距离分别为1.11 cM和0.82 cM,物理距离为246.3 kb。3.对该区域候选基因测序分析,发现LOCs07g04670在编码区第182位碱基发生突变(T→A),导致其编码蛋白第61位氨基酸改变(Leu→His)。等位性分析表明,Oslg-2, Oslg-3与Oslg-1属等位变异,进而对突变体Oslg-2和Oslg-3的OsLG基因进行测序,其突变分别发生在第316位(T→A)和119位(T→C)碱基,导致其编码的蛋白第106位氨基酸(Trp→Arg)和第40位氨基酸(Leu→Pro)发生突变。4.对该基因进行序列比对和同源进化分析,其与南美大颖稻较为相近,支持护颖系小花退化假说,该基因突变导致护颖伸长。5.对该类突变材料的候选基因和另一控制护颖性状的PAP2基因进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析,结果表明OsLG基因在水稻的叶片、穗、叶鞘和根中均有表达,且在穗部表达最高,而PAP2基因在除穗部以外的其它部位几乎不表达,表明2个控制护颖性状的基因均具有组织特异性,且PAP2基因的特异性更强。在长护颖突变体中,2个基因表达量均下调,表明其具有协同表达特点。第二部分温敏型突变体stripe 1-2和stripe 1-3中的核糖核苷酸还原酶小亚基负责叶绿素的生物合成本论文还对另两份水稻白条纹叶突变体stripe 1-2 (st1-2)和stripe1-3 (stl-3)进行了研究。stl-2和stl-3是利用甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulphonate, EMS)对9311进行诱变而来,并经过连续多代自交,条纹叶突变性状能够稳定遗传。主要研究结果如下：***-2和stl-3突变体在二叶期之前表型均正常,从二叶期开始均出现白色条纹状,到分蘖盛期条纹状明显加深。此外,stl-2随温度升高其条纹叶片叶绿素含量会缓慢升高,但直至成熟仍然呈条纹状;stl-3随温度升高叶绿素含量迅速增加,达到30℃后能够恢复生长出正常的绿叶。在农艺性状方面,包括株高、穗长、穗粒数、有效分蘖数、结实率及千粒重,stl-2和stl-3较之野生型均显著下降,且stl-2的千粒重和结实率极显著低于stl-3。2.光合速率在整个生长阶段,野生型比突变体高,具体顺序排列如下：WY>st1-3>st1-2。在不同的发育阶段,野生型中叶绿素a (Ch1a)含量显著高于突变体,叶绿素b (Ch1b)含量只在抽穗期略高于突变体,在其他阶段无明显差异。3.野生型、stl-2和stl-3的叶片亚显微结构的观察表明,在拔节期,野生型细胞中淀粉粒比突变体中的多,突变体的叶绿体中基粒和类囊体膜的层状结构折叠仍发育良好,与野生型相比没有显著差异;在抽穗期,stl-3叶绿体与野生型相比差异不大,但是stl-2的基质类囊体排列松散;在分蘖期和抽穗期,stl-2和stl-3中的嗜锇颗粒均比野生型显著增多。4.利用SSR标记将突变体st1-2基因定位在第6条染色体短臂的RM3438和RM3431之间,进一步设计Indel标记将该基因精细定位于InDel标记Ch6-819-1和Ch6-825-1之间,物理间距约为64kb。在stl-2定位区间中有四个功能基因,发现RNA小亚基基因(RNRS1:LOCOs06g14620)仅包含一个外显子,测序发现其在第511位碱基发生突变(G→T),导致其编码蛋白第171位氨基酸(Val→Phe)改变。突变体stl-3与stl-2等位,但突变位点与stl-2不同,其在第685位碱基发生突变(C→T),致其第229位氨基酸改变(Leu→Phe)。5.蛋白结构预测分析表明,RNRS1由15个α螺旋和loop组成。核糖核苷酸还原酶小亚基中的第171位的Val属于保守位点,且该突变位于α螺旋区域以及铁离子活性区,因此可能导致严重的表型变异。但是第229的Leu位点在酿酒酵母、老鼠、人等生物中均为脯氨酸,水稻中这个基因的序列与约氏疟原虫的位点一致。虽然这些序列存在一些差异,但是其二级结构均一

关键词：水稻长护颖突变体条纹叶突变体基因定位等位变异表达分析

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