检索结果-南通市图书馆

同方期刊数据库博看期刊评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Drp1基因条件性敲除大鼠模型构建及鉴定

Drp1基因条件性敲除大鼠模型构建及鉴定

作者：贾仙林内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的:基于Cre/LoxP系统,利用CRISPR/Cas9技术构建可进行肝脏特异性动力相关蛋白1(Drpl)基因条件性敲除(CKO)的flox杂合子大鼠模型。以期为深入研究Drp1的生物学功能提供实验基础。方法:1.通过NCBI Genebank找到编码Drp1的大鼠基因为Dnm... 详细信息

目的:基于Cre/LoxP系统,利用CRISPR/Cas9技术构建可进行肝脏特异性动力相关蛋白1(Drpl)基因条件性敲除(CKO)的flox杂合子大鼠模型。以期为深入研究Drp1的生物学功能提供实验基础。方法:1.通过NCBI Genebank找到编码Drp1的大鼠基因为Dnm1l,又称Drp1,分析Drp1基因序列,设计基因敲除靶点,确定g RNA靶点序列;同时构建同源重组载体并制备sg RNA和Cas9蛋白。2.采用显微注射方法,将制备好的sg RNA、Cas9蛋白及同源重组载体质粒的混合物直接注入单细胞受精卵,注射后的受精卵移植到代孕SD雌鼠的输卵管,等待子代F0出生,用PCR方法鉴定及测序获得阳性大鼠F0代。3.阳性大鼠F0代出生满8周,与8周野生型SD大鼠合笼,待产仔,仔鼠出生1周后,采用鼠尾PCR、基因测序及Southern Blot实验技术进行基因型鉴定,筛选子代获得阳性大鼠F1代。结果:成功构建打靶载体,经PCR鉴定确定与预定碱基数一致;利用CRISPR/Cas9技术成功获得打靶基因大鼠F0,并与野生型SD大鼠配繁后可稳定遗传,获得10只阳性F1代flox杂合子大鼠,经PCR及测序鉴定正确。Drp1基因flox杂合子大鼠表型无明显异常。结论:首次成功构建了Drp1基因条件性敲除的flox杂合子大鼠模型,为未来制备组织特异性敲除Drp 1基因的大鼠模型奠定基础,为深入研究Drp 1基因的功能和发现相关疾病发生的分子机制提供了可靠的体内实验模型。

关键词：条件性敲除 SD大鼠 Drp1 CRISPR/Cas9 Cre/LoxP

CCR3基因条件性敲除在变应性鼻炎骨髓CD34+祖细胞向嗜酸性粒细胞分化中的作用研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

CCR3基因条件性敲除在变应性鼻炎骨髓CD34+祖细胞向嗜酸性粒细胞...

作者：戴美娜南昌大学

学位级别：硕士

目的:利用Cre/lox P技术获得的骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠构造变应性鼻炎模型,观察实验小鼠鼻黏膜病理和黏液分泌情况,测定骨髓、外周血、鼻黏膜样本中CCR3、CD34差异表达情况,骨髓、外周血、鼻腔灌洗液(NALF)中CD34祖细胞、CD34C... 详细信息

目的:利用Cre/lox P技术获得的骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠构造变应性鼻炎模型,观察实验小鼠鼻黏膜病理和黏液分泌情况,测定骨髓、外周血、鼻黏膜样本中CCR3、CD34差异表达情况,骨髓、外周血、鼻腔灌洗液(NALF)中CD34祖细胞、CD34CCR3祖细胞、嗜酸性粒细胞(Siglec-FCCR3)比例变化,血清中嗜酸性粒细胞脱颗粒释放介质(嗜酸性粒细胞阳离子蛋白-ECP和嗜酸性粒细胞过氧化物酶-EPO)的差异情况;体外测定CD34祖细胞趋化及克隆形成情况,以观察骨髓细胞CCR3基因条件性敲除对变应性鼻炎CD34祖细胞向嗜酸性粒细胞分化作用的影响并初步探讨其增殖、迁移的作用机制。方法:1.利用骨髓细胞特异性表达Cre重组酶的Lyz-Cre C57BL/6小鼠与CCR3fl/fl C57BL/6小鼠杂交得到骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠;2.将繁殖得到的子代C57BL/6小鼠经基因型鉴定后分为4组:骨髓细胞CCR3基因条件性敲除对照组(CB组,CCR3-CKO control blank组)、骨髓细胞CCR3基因条件性敲除变应性鼻炎组(CA组,CCR3-CKO allergic rhinitis组)、同窝野生对照组(WB组,wildtype control blank组)、同窝野生变应性鼻炎组(WA组,wildtype allergic rhinitis组),以卵清蛋白(OVA)腹腔致敏、局部滴鼻给药激发,建立变应性鼻炎小鼠模型,对照组相同方式给予等量生理盐水;3.Western blot和qPCR检测各组小鼠骨髓、外周血及鼻黏膜中CD34和CCR3的m RNA及蛋白的表达变化;4.流式细胞术检测骨髓、外周血、NALF中CD34祖细胞、CD34CCR3祖细胞、嗜酸性粒细胞(Siglec-FCCR3)比例变化;5.在末次鼻腔激发后的10分钟对实验小鼠进行症状评分;每次给药前称量并记录小鼠体重;6.采用HE、PAS染色检测鼻黏膜的组织病理形态及黏液分泌情况;7.应用ELISA测定血清中IL-5、eotaxin、ECP和EPO的浓度及其变化;8.a.磁珠分选CD34祖细胞体外培养观察骨髓、外周血CD34祖细胞迁移能力变化;b.骨髓非粘附单个核细胞(NAMNC)克隆形成情况。结果:1.成功构建骨髓细胞CCR3基因条件性敲除(CCR3-CKO)小鼠,CCR3-CKO小鼠骨髓细胞CCR3的m RNA和蛋白表达水平均明显减少;2.Western blot和qPCR结果表明,与WA组相比,CA组的小鼠骨髓、外周血中CD34和骨髓、外周血、鼻黏膜中CCR3的m RNA及蛋白表达均减低;3.流式细胞术结果表明,与WA组相比,CA组的小鼠骨髓、外周血中CD34祖细胞、CD34CCR3祖细胞和骨髓、外周血、NALF中嗜酸性粒细胞(Siglec-FCCR3)比例均减少;4.骨髓细胞CCR3基因条件性敲除后,可减轻变应性鼻炎小鼠的症状,并在一定程度上缓解了变应性鼻炎引起的体重下降;5.HE染色显示与WA组相比,CA组小鼠鼻黏膜病理改变减轻;6.PAS染色显示与WA组相比,CA组小鼠黏液分泌减少;7.在小鼠血清中,ELISA分析发现CA组血清中IL-5、ECP和EPO水平均较WA组降低,而eotaxin水平在CA组较WA组更高;8.transwell结果表明CA组小鼠骨髓CD34祖细胞对eotaxin的反应弱于WA组,迁移能力部分降低;9.克隆形成结果显示在IL-5和eotaxin共同刺激下可诱导WA组小鼠骨髓非黏附单个核细胞(NAMNC)克隆形成嗜酸性粒细胞,而骨髓细胞CCR3基因条件性敲除使小鼠骨髓NAMNC克隆形成能力较同窝野生型减弱。结论:骨髓细胞CCR3基因条件性敲除使变应性鼻炎小鼠骨髓CD34祖细胞骨髓造血和原位造血能力下降;下调骨髓细胞CCR3基因可抑制骨髓CD34祖细胞向嗜酸性粒细胞的分化,并抑制嗜酸性粒细胞在局部组织的迁移、浸润及脱颗粒作用。CCR3可能作为靶基因从造血源头上影响CD34祖细胞向嗜酸性粒细胞分化并调控变应性鼻炎的发病。

关键词：变应性鼻炎 CCR3基因条件性敲除 CD34+祖细胞嗜酸性粒细胞

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

条件性敲除Llgl1基因小鼠的制备与鉴定

条件性敲除Llgl1基因小鼠的制备与鉴定

作者：刘毅上海交通大学

学位级别：硕士

Lgl（lethal giant lavae）基因首先在果蝇中发现,该基因非常保守,在线虫、果蝇、哺乳动物以及人类当中都存在同源基因。随着研究的深入,人们发现该基因对于细胞极性的形成与维持至关重要,而细胞极性的丧失正是肿瘤发生与转移的重要指标... 详细信息

Lgl（lethal giant lavae）基因首先在果蝇中发现,该基因非常保守,在线虫、果蝇、哺乳动物以及人类当中都存在同源基因。随着研究的深入,人们发现该基因对于细胞极性的形成与维持至关重要,而细胞极性的丧失正是肿瘤发生与转移的重要指标,因此,Lgl基因与肿瘤发生具有相关性。在许多癌症病例中均发现了Hugl-1（人源Lgl1）的降低表达或不表达,但目前并没有相关报道支持Hugl-1作为抑癌基因,即该基因发生肿瘤特异性突变的报道,且对于Hugl-1在特定器官癌症（如肝癌）的发生发展中的作用还不清楚。由于实验材料采集以及伦理道德方面的约束,目前国内无法直接利用人来源的胚胎干细胞进行基因敲除方面的研究,更无法通过实验手段人为地构建将某个基因敲除的人类个体以此研究该基因在个体各发育阶段或某个特定器官中的功能。因此,大量基因敲除方面的研究,都要通过实验动物来进行,而小鼠就是使用得最广泛的实验动物之一。本研究参考了国际上比较通用的几种基因敲除策略并将其整合,构建了Llgl1（小鼠来源Lgl1）条件性敲除质粒,通过电击转化胚胎干细胞、囊胚注射等传统手法,成功获得了在肝脏当中敲除Llgl1基因的敲除小鼠,并观察到了该类敲除小鼠具有在体重上较野生型小鼠轻的表型本构建策略鉴定方便,又利于简单改造,只需对载体进行小规模修饰即可对其它基因进行构建,亦可通过简单的酶切连接反应对载体进行修饰,用于构建纯合敲除的胚胎干细胞克隆。

关键词： Llgl1 条件性敲除基因敲除敲除小鼠

条件性敲除软骨细胞Indian hedgehog力学—生物学特性变化的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

条件性敲除软骨细胞Indian hedgehog力学—生物学特性变化的研究

作者：张博山西医科大学

学位级别：硕士

目的:与正常细胞比较,分析敲除Ihh基因的软骨细胞在体外培养过程中的力学—生物学特性变化,明确Ihh基因在软骨细胞力学-生物学特性维持作用。方法:1、取刚出生的Ihhfl/fl纯合并具有Col2a1-Cre ERt2的基因工程小鼠40只,随机分为实验组与... 详细信息

目的:与正常细胞比较,分析敲除Ihh基因的软骨细胞在体外培养过程中的力学—生物学特性变化,明确Ihh基因在软骨细胞力学-生物学特性维持作用。方法:1、取刚出生的Ihhfl/fl纯合并具有Col2a1-Cre ERt2的基因工程小鼠40只,随机分为实验组与对照组,实验组腹腔注射TM(Tamoxifen),对照组腹腔注射等量的植物油,连续注射5天后,急性分离肋软骨细胞。2、实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Ihh基因相对表达量,明确Ihh基因的敲除效率。3、CCK-8法和流式细胞术检测同一时间点实验组与对照组肋软骨细胞的增殖和凋亡(n=10)。4、RT-PCR检测Col I、Gli-1、Col II、Col X、Agg和Mmp13的m RNA表达水平的变化(n=5)。5、微管吸吮技术及半无限体细胞力学模型测定Ihh基因敲除后肋软骨细胞力学特性的变化(n=5)。结果:1、CCK-8检测发现,敲除Ihh基因后,软骨细胞增殖效率较对照组降低,其中48h、72h最为显著,450nm波长吸光度分别为(0.534±0.15)、(0.722±0.13)(p性发现:瞬时模量(E0)、平衡模量(E∞)、表观黏性(μ)均相对于对照组较高(P条件性敲除软骨细胞Ihh基因后能够有效的提高软骨细胞Col II和Agg的表达,抑制Col X和Mmp13的表达。并且软骨细胞力学特性明显的增加。提示,敲除Indian hedgehog基因对于优化种子细胞具有一定的价值。

关键词： Indian hedgehog 条件性敲除软骨细胞生物学力学

基于生长素诱导降解系统条件性敲除弓形虫ATG6蛋白的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国预防兽医学报 2019年第10期41卷 1015-1020页

作者：陈运通陈赫明付佳雯庞宇郑君贾洪林中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为构建生长素诱导降解系统的弓形虫条件性基因缺失虫株,本研究首先利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选获得Tg Ku80基因缺失虫株,然后采用该缺失虫株,利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选,将生长素诱导降解因子(AID)插入该弓形虫Tg A... 详细信息

为构建生长素诱导降解系统的弓形虫条件性基因缺失虫株,本研究首先利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选获得Tg Ku80基因缺失虫株,然后采用该缺失虫株,利用CRISPR/Cas9方法和流式细胞术筛选,将生长素诱导降解因子(AID)插入该弓形虫Tg ATG6基因序列的5’端得到TgATG6条件性敲除虫株TgATG6-i KD。PCR扩增及测序结果显示,以TgATG6-iKD虫株为模板可扩增出AID标签,而在野生型虫株中,不能有效扩增该靶序列,经测序验证也得到相符结果,表明AID标签序列能够高效定点插入到弓形虫Tg Ku80基因缺失虫株中;通过蛋白免疫印迹试验能够在TgATG6条件性敲除虫株检测到AID标签和TgATG6蛋白的融合表达;蛋白免疫印迹试验及间接免疫荧光实验结果显示,利用生长素(NAA)能够快速诱导融合表达蛋白的降解。本研究通过蛋白N端融合AID共表达,建立了高效条件性敲除弓形虫基因的方法,为进一步研究弓形虫相关基因的功能奠定基础。

关键词：弓形虫植物生长激素条件性敲除 TgATG6

肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠的构建及鉴定

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

上海交通大学学报（医学版） 2016年第10期36卷 1403-1407页

作者：应霁刘剑张沥文仲芳周芳芳王伟铭上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科上海200025

目的·构建肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠,并进行表型鉴定,为进一步研究C/EBPα在肾间质纤维化中的作用奠定基础。方法·利用C/EBPα^(flox/flox)和pepck-Cre^+转基因小鼠进行饲养和杂交;将繁殖产生的第1代小鼠再次进行交配,得到... 详细信息

目的·构建肾小管上皮细胞C/EBPα条件性敲除小鼠,并进行表型鉴定,为进一步研究C/EBPα在肾间质纤维化中的作用奠定基础。方法·利用C/EBPα^(flox/flox)和pepck-Cre^+转基因小鼠进行饲养和杂交;将繁殖产生的第1代小鼠再次进行交配,得到第2代小鼠。通过PCR鉴定出基因型为C/EBPα^(flox/flox).pepck-Cre^+的小鼠(C/EBPα^(-/-)小鼠)。采用RT-q PCR及免疫组织化学法分别检测肾组织中C/EBPαmRNA和蛋白表达水平。应用H-E染色、Masson染色观察6~8周龄C/EBPα^(-/-)小鼠及野生型(WT)小鼠肾脏组织形态学改变。结果·2种转基因小鼠繁殖产生的第2代小鼠基因型符合孟德尔遗传定律,交配后获得C/EBPα^(-/-)小鼠。与WT小鼠相比,C/EBPα^(-/-)小鼠肾脏中C/EBPαmRNA及蛋白表达水平下降,光学显微镜下肾脏组织形态无明显改变。结论·应用Cre-loxp系统可以成功地敲除小鼠肾小管上皮细胞中C/EBPα基因,且在基础情况下C/EBPα^(-/-)小鼠肾脏组织无明显形态学改变。

关键词： Cre-loxp系统 C/EBPα 条件性敲除肾小管上皮细胞

巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠的构建及功能分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国实验动物学报 2023年第4期31卷 428-436页

作者：秦琪李娟杨柳方亮陈丽华西北大学生命科学学院西安710069 空军军医大学基础医学院免疫学教研室西安710032

目的构建并鉴定巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,为研究CD226分子调节巨噬细胞表型和功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法通过Cd226^(flox/+)雌雄小鼠自交,得到基因型Cd226^(flox/flox)小鼠。Cd226^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠... 详细信息

目的构建并鉴定巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,为研究CD226分子调节巨噬细胞表型和功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法通过Cd226^(flox/+)雌雄小鼠自交,得到基因型Cd226^(flox/flox)小鼠。Cd226^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠杂交,获得Cd226^(flox/+)Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Cd226^(flox/flox)小鼠杂交,最终获得Cd226^(flox/flox)Lyz2-Cre^(+)小鼠,即巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型;采用流式细胞术、qRT-PCR和Western Blot验证小鼠巨噬细胞CD226敲除效果;采用Transwell实验检测CD226对小鼠巨噬细胞迁移能力的影响。结果从基因和蛋白水平证实巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠构建成功。Transwell实验结果显示,与对照组相比,巨噬细胞条件性敲除CD226分子显著抑制腹腔巨噬细胞的迁移。结论成功构建巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,为后续深入研究CD226调控巨噬细胞功能在免疫性疾病发病中的作用和机制提供更加精准的实验动物模型。

关键词： CD226 条件性敲除基因型鉴定巨噬细胞迁移

p53凋亡刺激蛋白2基因肝脏条件性敲除小鼠的构建和鉴定

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

实用肝脏病杂志 2022年第2期25卷 170-174页

作者：寇卜心柴梦音豆双双庞丽君陈德喜刘晓霓首都医科大学附属北京佑安医院/北京市肝病研究所/北京市肝炎与肝癌精准医疗及转化工程技术研究中心北京市100069

目的采用Cre-LoxP系统构建p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因肝脏条件性敲除小鼠。方法利用自行设计的sgRNA序列,在ASPP2基因两端插入LoxP序列,构建ASPP2-flox小鼠。采用PCR法和测序法对F0代和F1代小鼠进行基因型鉴定。将ASPP2-flox F1小鼠... 详细信息

目的采用Cre-LoxP系统构建p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因肝脏条件性敲除小鼠。方法利用自行设计的sgRNA序列,在ASPP2基因两端插入LoxP序列,构建ASPP2-flox小鼠。采用PCR法和测序法对F0代和F1代小鼠进行基因型鉴定。将ASPP2-flox F1小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏敲除ASPP2基因小鼠。采用PCR法进行基因型鉴定。采用Westernblot和免疫组化法检测ASPP2基因肝脏敲除小鼠肝脏ASPP2蛋白表达。结果对F0代和F1代动物基因行PCR和测序结果表明,构建ASPP2-flox小鼠成功;F1代杂合子的基因型为ASPP2^(fl/-);将F1代杂合子与Alb-Cre小鼠进行杂交后,回交ASPP2^(fl/-)小鼠,其基因型为ASPP2^(fl/fl) Cre^(T),即为ASPP2肝脏条件性敲除小鼠;经Western blot和免疫组化法检测显示ASPP2^(fl/fl) Cre^(T)小鼠肝脏ASPP2蛋白表达显著减少。结论基于Cre-LoxP系统成功构建ASPP2基因肝脏条件性敲除小鼠,为后续实验作了良好的基础。

关键词： Cre-LoxP系统 p53凋亡刺激蛋白2 条件性敲除小鼠

蛋白激酶CK2转基因小鼠和条件性敲除小鼠模型的构建及初步表型分析

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

蛋白激酶CK2转基因小鼠和条件性敲除小鼠模型的构建及初步表型分析

作者：孙鹏飞深圳大学

学位级别：硕士

衰老是生物体在外部环境,遗传因素或内源性因素刺激下体现在个体水平、组织细胞水平和分子水平等全身性渐进性的退化过程。其主要原因包括基因组不稳定性,端粒缩短,表观遗传学改变,蛋白内稳态丧失,营养感应失调,线粒体功能异常,细胞衰老... 详细信息

衰老是生物体在外部环境,遗传因素或内源性因素刺激下体现在个体水平、组织细胞水平和分子水平等全身性渐进性的退化过程。其主要原因包括基因组不稳定性,端粒缩短,表观遗传学改变,蛋白内稳态丧失,营养感应失调,线粒体功能异常,细胞衰老,干细胞耗竭和细胞间信息交换改变。衰老的一个特征是功能失调的细胞器、DNA突变、氧化蛋白和脂质的积累,这些都会导致细胞正常生理功能的逐渐下降,并导致与年龄有关的疾病的发生。衰老是心血管疾病发生的主要危险因素。心脏衰老表现为心脏功能降低、左心室肥大、心肌纤维化和细胞凋亡,心肌细胞为有丝分裂后细胞,特别容易受到年龄相关的细胞损伤,很难被替换。因此与衰老关系密切。研究心肌细胞在衰老过程中形态功能变化可以反映心脏衰老与疾病的联系。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CK2与多种细胞过程有关,包括细胞生长、细胞增殖和细胞凋亡。这些细胞过程的细胞功能、胚胎发生、器官稳态以及肿瘤发生和迁移至关重要。有研究表明,CK2参与胚胎心脏发生,敲除CK2α引发胚胎心脏和神经系统发育不全,导致胚胎致死。过表达CK2可以引起心肌肥大,可能与心肌细胞过度增值有关。近年来发现CK2是DNA损伤修复的重要参与者,在衰老过程中具有重要意义,CK2的酶活性受到衰老相关分子如P53,P21的抑制。用于癌症治疗的药物CK2抑制剂可引起细胞衰老,CK2β活性的下调可导致线虫的细胞衰老。因此,通过构建CK2相关小鼠模型可以帮助我们更好的了解衰老的机制以及这些细胞的改变如何促进与年龄相关的病理是非常重要的。我们研究的目的在于在构建CK2α转基因和心脏特异性敲除小鼠模型的基础上,探究CK2与衰老以及心脏衰老之间的联系。结果:(1)成功构建CK2α小鼠,发现其体重减轻,糖耐量增加,心脏出现心肌肥大表型。(2)初步完成构建心肌特异性条件敲除CK2α小鼠模型(MYH-cre-CK2),在小鼠8周龄时经过Tamoxifen诱导后,10天后观察CK2α小鼠出现心脏扩张,衰老相关标志物P21升高,心脏纤维化增加,心功能下降(EF和FS降低)等表型。总结:我们构建的CK2α小鼠其体重减轻,糖耐量增加,说明CK2α与糖脂代谢可能存在密切联系,而其心脏的肥大和条件特异性性敲除后的心脏扩张、心脏纤维化以及P21升高等表型说明CK2α与心脏衰老密切相关。

关键词：蛋白激酶CK2 条件性敲除心肌肥大衰老