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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2013年第2期41卷 182-188页

作者：高履桐陈翠翠师宝君胡兆农西北农林科技大学农药研究所陕西杨凌712100

【目的】合成并鉴定杠柳新苷t人工抗原,制备多克隆抗体,为进一步开展杠柳新苷类化合物作用机理的研究奠定基础。【方法】以杠柳新苷t为起始反应物,与丁二酸酐反应生成杠柳新苷t的衍生物(半抗原),采用HPLC-ELSD、MS和NMR对衍生物的结构... 详细信息

【目的】合成并鉴定杠柳新苷t人工抗原,制备多克隆抗体,为进一步开展杠柳新苷类化合物作用机理的研究奠定基础。【方法】以杠柳新苷t为起始反应物,与丁二酸酐反应生成杠柳新苷t的衍生物(半抗原),采用HPLC-ELSD、MS和NMR对衍生物的结构进行鉴定;将半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)进行偶联,采用紫外图谱对人工抗原进行鉴定,并采用2,4,6-三硝基苯磺酸(tNBS)法测定结合比;以乳化的人工抗原免疫8周龄雌性Balb/c小鼠获得杠柳新苷t的多克隆抗体,并测定其效价。【结果】成功合成杠柳新苷t的半抗原和人工抗原,半抗原和载体蛋白(BSA和OVA)的结合比分别为5∶1和7∶1。免疫小鼠后产生针对杠柳新苷t的特异性抗体,其效价为1∶1 600,对杠柳新苷t的半数抑制浓度(IC50)为12.429 4μg/mL。【结论】制备了杠柳新苷t的多克隆抗体,可以用于杠柳新苷t作用靶标的定位研究。

关键词：杠柳新苷t 半抗原人工抗原多克隆抗体

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杠柳新苷t作用东方粘虫幼虫中肠细胞的免疫定位研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2015年第11期43卷 118-122,128页

作者：左佳妮孙文聪冯明星胡兆农吴文君西北农林科技大学农药研究所

【目的】明确杠柳新苷t作用后在东方粘虫幼虫中肠肠壁细胞中的分布,探讨其杀虫作用机制。【方法】鉴于杠柳新苷t对东方粘虫幼虫具有明显的胃毒活性,而对小地老虎幼虫无杀虫活性,采用胶体金免疫电镜技术,比较观察了杠柳新苷t处理的东方... 详细信息

【目的】明确杠柳新苷t作用后在东方粘虫幼虫中肠肠壁细胞中的分布,探讨其杀虫作用机制。【方法】鉴于杠柳新苷t对东方粘虫幼虫具有明显的胃毒活性,而对小地老虎幼虫无杀虫活性,采用胶体金免疫电镜技术,比较观察了杠柳新苷t处理的东方粘虫幼虫和小地老虎幼虫中肠肠壁细胞的变化。【结果】东方粘虫幼虫经杠柳新苷t处理后,胶体金颗粒首先出现在微绒毛上,且密度随着处理时间延长而逐渐增大,最终破坏微绒毛;同时,胶体金颗粒在细胞内的细胞器膜上也有出现,并损伤细胞器。小地老虎幼虫经杠柳新苷t处理后,中肠肠壁细胞及细胞器均没有明显变化,其上也没有发现胶体金颗粒的存在。【结论】杠柳新苷t对东方粘虫幼虫和小地老虎幼虫的选择性与其在2种试虫中肠肠壁细胞上的特异性结合存在显著差异有关,杠柳新苷t作用东方粘虫幼虫后的初始结合部位可能是其中肠肠壁细胞,推测杠柳新苷t的靶蛋白可能存在于中肠肠壁细胞膜及细胞器膜上。

关键词：杠柳新苷t 东方粘虫小地老虎中肠肠壁细胞免疫定位

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杠柳新苷t的分离及多克隆抗体的制备

杠柳新苷T的分离及多克隆抗体的制备

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作者：高履桐西北农林科技大学

学位级别：硕士

从天然产物中筛选具有生物活性的先导化合物并以其为探针发现新靶标，是当前新农药创制的重要途径。基于这一思路，本研究在生物活性的追踪下，对杠柳Periplocasepium根皮杀虫活性成分进行了较为系统的研究。并选择具有较高杀虫活性的... 详细信息

从天然产物中筛选具有生物活性的先导化合物并以其为探针发现新靶标，是当前新农药创制的重要途径。基于这一思路，本研究在生物活性的追踪下，对杠柳Periplocasepium根皮杀虫活性成分进行了较为系统的研究。并选择具有较高杀虫活性的杠柳新苷t进行多克隆抗体的制备，为其作用靶标的定位研究奠定基础。主要研究结果如下： 1．在生物活性追踪方法的指导下，采用硅胶柱层析分离和高效液相色谱（HPLC）切分，从杠柳根皮的甲醇提取物中分离出6个化合物，通过波谱学(MS、2D-NMR和1D-tOCSY等)方法进行结构鉴定，其分别为3个已知化合物：杠柳新苷D、杠柳新苷E和杠柳新苷F;3个未见报道的新化合物：杠柳新苷P、杠柳新苷t和杠柳新苷U。生物活性测定结果表明，杠柳新苷D、F、P和t对3龄粘虫Mythimna separata和小菜蛾Plutella xyllostella具有毒杀活性。对3龄粘虫48h的胃毒致死中浓度（LC50）分别为0.39、0.34、0.11和0.07mg/mL，对小菜蛾48h的胃毒LC50值分别为1.21、1.39、0.89和0.35mg/mL。中毒症状观察表明：其中毒症状与试虫对杠柳毒素NW的中毒症状相同，推测这些杠柳新苷类化合物可能主要作用于昆虫的消化系统。 2．以高活性化合物杠柳新苷t为起始反应物，与琥珀酸酐反应生成杠柳新苷t的衍生物（半抗原）;采用碳二亚胺法分别将半抗原与载体蛋白（BSA、OVA）进行偶联，制备杠柳新苷t的人工抗原。利用液相色谱(HPLC-ELSD)、质谱（MS）和核磁共振波谱（NMR）对杠柳新苷t的衍生物进行表征，并用紫外扫描法（UV）和红外光谱（IR）对人工抗原进行鉴定，采用2,4,6-三硝基苯磺酸比色法(tNBS)对人工抗原的结合比进行测定。结果表明，成功制备出杠柳新苷t的半抗原和人工抗原，半抗原和载体蛋白（BSA和OVA）的结合比分别为5:1和7:1。 3．用杠柳新苷t的人工抗原（hapten-BSA）免疫8周龄Balb/c小白鼠。采用酶联免疫法（ELISA）测定抗体效价，并对ELISA检测条件进行初步优化;选择与杠柳新苷t结构相似的杠柳新苷P和E进行交叉反应率测定。结果表明：最佳包被抗原质量浓度为10μg/mL，抗体最高效价为1600。抗血清竞争性抑制试验表明，制备的抗体对杠柳新苷t具有很强的亲和性，其半数抑制浓度（IC50）为12.4294μg/mL。抗体与杠柳新苷P和E的交叉反应率分别为25.6%和8.6%。

关键词：杠柳新苷t 生物活性人工抗原多克隆抗体

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杠柳新苷t对黑腹果蝇幼虫感觉—中枢神经系统—运动回路的影响

杠柳新苷T对黑腹果蝇幼虫感觉—中枢神经系统—运动回路的影响

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作者：任亚鑫西北农林科技大学

学位级别：硕士

在神经信号传导的过程中V-AtP酶不仅为突触囊泡中神经递质的合成、分泌、摄取和再储存提供动能,同时还参与囊泡中神经递质的释放。杠柳新苷t(PSt)是从植物杠柳(Periploca sepium Bunge)根皮中分离得到的具有较高杀虫活性的杠柳新苷类化... 详细信息

在神经信号传导的过程中V-AtP酶不仅为突触囊泡中神经递质的合成、分泌、摄取和再储存提供动能,同时还参与囊泡中神经递质的释放。杠柳新苷t(PSt)是从植物杠柳(Periploca sepium Bunge)根皮中分离得到的具有较高杀虫活性的杠柳新苷类化合物,前期研究发现PSt可浓度依赖性抑制东方黏虫(Mythimna Separata)幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)中的V-AtP酶活性。基于此,本研究以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)幼虫为供试昆虫,PSt为供试药剂,对四种来源相同但神经系统基因背景不同的黑腹果蝇幼虫w(野生型品系,源自Oregon-R)、para(源自Oregon-R品系钠通道I265N点突变所产生的抗菊酯类杀虫剂突变品系)、para;DSC1(para品系敲除DSC1通道的突变品系)和DSC1(w敲除DSC1通道的突变品系)的毒力和行为学特性进行了研究。并运用细胞内微电极技术比较了PSt对四种果蝇品系幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路电位活动的影响,明确杠柳新苷类化合物是否通过作用于突触V-AtP酶影响神经回路的兴奋性传导,旨在阐明其杀虫作用机理。论文主要结果如下:1.毒力测定表明,四种果蝇品系幼虫对PSt的敏感性从高到低依次为:para、w、para;DSC1、DSC1。敲除DSC1通道的DSC1品系对PSt的敏感性最低,与w有显著性差异,其LC是w的1.66倍;para品系与para;DSC1品系相比,敲除DSC1通道后幼虫对PSt的敏感性降低。行为学测定表明,四种果蝇品系在正常状态下对机械触觉刺激的反应、体壁运动能力无显著性差异,但嘴钩运动能力有显著性差异,这说明神经系统基因背景的差异对行为产生的影响不同。饲喂500 mg/L的PSt 48 h后,对机械刺激的敏感性降低,但饲喂前后没有显著性差异;体壁运动和嘴钩运动能力显著降低,未敲除DSC1通道的w和para品系幼虫的运动能力降低幅度显著大于敲除DSC1通道的para;DSC1和DSC1品系。2.对四种果蝇品系幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路电位活动的测定表明,正常状态下未敲除DSC1通道的w和para品系的EJP频率显著低于敲除DSC1通道的para;DSC1和DSC1品系;在记录的20 min内,四种果蝇品系兴奋性衰减趋势无明显差异,但敲除DSC1通道的两种品系与未敲除的两种品系相比衰减趋势较为缓慢,这表明正常状态下DSC1通道在幼虫神经回路活动中通过起负向调节的作用来维持神经系统的稳定性。3.用4μM PSt处理果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路离体标本,PSt加快了神经回路EJP频率的衰减,抑制了果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路兴奋性的传导,四种果蝇品系被抑制程度无显著性差异。2μM BA1处理幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路离体标本,BA1也加快了神经回路EJP频率的衰减,抑制了果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路兴奋性的传递,四种果蝇品系被抑制程度也无显著性差异。经PSt处理后的感觉-中枢神经系统-运动回路EJP频率下降趋势与BA1处理基本一致,这表明PSt和BA1作用类似,都是通过抑制V-AtP酶的活性抑制果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路兴奋性的传导。4.幼虫离体标本感觉-中枢神经系统-运动回路经PSt和BA1处理后,四种果蝇品系神经系统兴奋性传递被抑制的幅度无显著性差异但敲除DSC1通道的两种品系EJP频率下降幅度较小,这个结果与毒力测定和行为学测定结果一致,即敲除DSC1通道后,果蝇幼虫对PSt和BA1的敏感性降低。推测在逆境条件下DSC1通道为维持神经回路稳定性可能发挥正向调节作用,增强了兴奋性传导,但PSt或BA1在神经回路中主要通过作用于突触前膜V-AtP酶抑制兴奋性传导,因此敲除DSC1通道的果蝇品系幼虫由于缺乏这一调节机制,导致对PSt和BA1的敏感性降低,表现出EJP频率下降幅度较小。上述结果从神经电生理的角度进一步证实了PSt和BA1一样通过抑制V-AtP酶的活性抑制果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路的兴奋性传导,四种品系果蝇幼虫对PSt敏感性的差异可能与DSC1通道在调节神经系统稳定性方面的作用有关,是神经系统遗传背景的差异所致。

关键词：杠柳新苷t V-AtP酶感觉-中枢神经系统-运动回路 DSC1通道黑腹果蝇

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10%杠柳根皮提取物微乳剂的研制

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西北农业学报 2013年第12期22卷 201-206页

作者：孙文聪白建军师宝君胡兆农西北农林科技大学农药研究所陕西杨凌712100

通过对溶剂、助表面活性剂和乳化剂的筛选，成功配制出10％杠柳根皮提取物微乳剂。所制微乳剂成分为：w=10％的杠柳根皮浸膏，w=5％的DBca，w=10％的农乳400，w=21％的甲醇。w=12％的环己酮，其余用水补足至100％。主要技术指标：杠柳... 详细信息

通过对溶剂、助表面活性剂和乳化剂的筛选，成功配制出10％杠柳根皮提取物微乳剂。所制微乳剂成分为：w=10％的杠柳根皮浸膏，w=5％的DBca，w=10％的农乳400，w=21％的甲醇。w=12％的环己酮，其余用水补足至100％。主要技术指标：杠柳根皮浸膏质量分数10％，其中有效成分杠柳新苷t的质量分数为0．08％；外观为黄色透明均相液体；pH为5～8；透明温度范围为=5～70℃；与水可以任意比互溶；制剂反复冷冻后，在室温下能自行恢复为透明均相液体；（54±2）℃的条件下，贮存14d，杠柳新苷t的分解率为4．8％（〈8％）。各项技术指标均符合商品农药的要求，田间药效表明该制剂对菜青虫有较好的防效，具有推广价值。

关键词：植物源杀虫剂杠柳新苷t 微乳剂田间药效菜青虫

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