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植物生理学报 2023年第11期59卷 2027-2038页

作者：吉军张玉琎肖鑫高燕燕王利琴张静怡张明生贵州大学生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵阳550025 贵州医科大学药学院贵阳550025

本研究探究了真菌白假鬼伞与杜鹃兰种子共培养萌发中漆酶在杜鹃兰种皮木质素降解过程中的作用。实验基于白假鬼伞转录组数据,采用生物信息学方法,从白假鬼伞中共鉴定出13个CdLac基因(CdLac1~13)。上述基因编码蛋白质分子质量为46.97~66.... 详细信息

本研究探究了真菌白假鬼伞与杜鹃兰种子共培养萌发中漆酶在杜鹃兰种皮木质素降解过程中的作用。实验基于白假鬼伞转录组数据,采用生物信息学方法,从白假鬼伞中共鉴定出13个CdLac基因(CdLac1~13)。上述基因编码蛋白质分子质量为46.97~66.25 kDa,均具有真菌漆酶铜离子结合区域的特征序列及4个能够结合催化底物的环形结构,且大多数具有信号肽序列,属于分泌型的胞外蛋白。系统发育分析表明,该基因家族与灰盖鬼伞的同源性较高。与对照相比,白假鬼伞与杜鹃兰种子共培养6 d后,有7个CdLac基因表达明显上调;共培养12 d后,该真菌中胞外漆酶活性最高。提示白假鬼伞与杜鹃兰种子共培养互作过程中,白假鬼伞分泌的漆酶对杜鹃兰种皮木质素降解可能发挥了重要作用。

关键词：漆酶 CdLac基因家族白假鬼伞杜鹃兰种子木质素降解

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白假鬼伞降解杜鹃兰种皮木质纤维素的作用机理

白假鬼伞降解杜鹃兰种皮木质纤维素的作用机理

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作者：吉军贵州大学

学位级别：硕士

杜鹃兰(Cremastra appendiculata（***）Makino)为兰科杜鹃兰属多年生珍稀药用草本植物,其以干燥的假鳞茎入药。自然条件下,杜鹃兰种子萌发率极低,且萌发周期较长。基于前期本课题组筛选了一株促杜鹃兰种子萌发的真菌—白假鬼伞（Coprin... 详细信息

杜鹃兰(Cremastra appendiculata（***）Makino)为兰科杜鹃兰属多年生珍稀药用草本植物,其以干燥的假鳞茎入药。自然条件下,杜鹃兰种子萌发率极低,且萌发周期较长。基于前期本课题组筛选了一株促杜鹃兰种子萌发的真菌—白假鬼伞（Coprinellus disseminatus）,该菌能够很好的促进杜鹃兰种子萌发,且萌发率达到71%左右,其可能是种皮抑制了胚的发育,严重影响了种胚的透气性与营养物质的吸收。然而,白假鬼伞明显促进杜鹃兰种子萌发,可能是真菌可分泌相关木质纤维素降解酶系降解种皮木质纤维素,从而打破了种子萌发的物理屏障,同时增强杜鹃兰种子种胚的吸水及透气性,有利于种子吸收水分和营养物质。本研究为杜鹃兰与白假鬼伞共生过程中种胚的发育奠定基础。主要研究结果如下:（1）首先通过白假鬼伞进行发酵培养降解外源木质素的实验,验证了该白假鬼伞分泌相关酶能够降解外源木质素。测定共培养0 d、6 d、12 d的种子半纤维素、木质素含量,以0 d种子为对照,共培养6 d、12 d种子木质素与半纤维素含量都下降,共培养12 d时种子木质素含量减少更快,达到显著性差异。本研究对共培养0 d～15 d种子进行树脂切片,观察共培养12 d后种子种皮几乎消失不见,种胚细胞增殖变大,种子细胞有大量的菌丝侵入,共培养13 d以后种皮消失。通过对共培养不同时期的培养基胞外木质纤维素酶活的测定,发现漆酶、纤维素酶以及木聚糖酶活性在共培养12 d时较高。综上所述,共培养12 d是白假鬼伞对杜鹃兰种子种皮木质纤维素作用的最佳培养时间。（2）利用愈创木酚法和羧甲基纤维素钠法定性验证白假鬼伞漆酶与纤维素酶与木聚糖酶的能力,并以白假鬼伞与杜鹃兰种子共培养12 d木质纤维素降解酶条件的优化。白假鬼伞可以使愈创木酚培养基变成红棕色,羧甲基纤维素钠培养基褪色,说明白假鬼伞具有产生漆酶与纤维素酶的能力。通过白假鬼伞与杜鹃兰种子共培养12 d胞外培养基的酶活测定,先进行单因素产酶较适宜条件培养基筛选,最后进行营养因素的正交实验,筛选出产酶活的较适宜条件:20 g·L麦芽糖、2 g·L蛋白胨、1 g·LMg以及培养基p H=6,蒸馏水定容至1 L。（3）本研究根据上述正交实验优化出白假鬼伞产酶较适宜条件下,将白假鬼伞与杜鹃兰种子共培养12 d。基于白假鬼伞转录组数据,筛选白假鬼伞相关木质纤维素降解酶基因,对筛选出的真菌木质纤维素降解酶基因进行实时荧光定量PCR以及种子木质素、半纤维素含量的测定,探究白假鬼伞相关的木质纤维素酶基因对种皮木质纤维素降解的影响。结果表明:与对照组相比,有1个乙二醛氧化酶基因、2个纤维素酶基因、1个染料脱色氧化酶基因、1个过氧化氢酶基因、1个葡萄糖氧化酶基因以及5个漆酶基因表达上调。测定杜鹃兰种子木质素与半纤维素含量:木质素含量显著下降,与其相关的木质素降解酶基因表达明显上调,达到显著性差异,这与生理测定的结果相一致;木聚糖酶基因表达差异不显著,半纤维素含量也下降,统计学上未达到显著性差异,与生理测定的结果也相一致;2个纤维素酶基因表达上调。说明白假鬼伞在杜鹃兰种子共培养过程中可以分泌相关木质纤维素酶降解杜鹃兰种子种皮木质纤维素。

关键词：白假鬼伞杜鹃兰种子共培养木质纤维素降解酶木质纤维素降解

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