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杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体的比较蛋白质组学分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第2期27卷 102-106页

作者：敬保迁邓世山张仁刚张洁川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637000

目的应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况。方法分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶图像... 详细信息

目的应用蛋白质组学技术分析杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体蛋白质表达状况。方法分别提取和纯化杜氏利什曼原虫四川SC6株前鞭毛体与纯培养无鞭毛体的总蛋白,分别经pH3～10的预制胶条进行双向电泳分离,凝胶用考马斯亮蓝染色,凝胶图像以PDQuest1.0软件分析,并对主要差异表达蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的前鞭毛体与纯培养的无鞭毛体总蛋白经双向电泳分离后均可获近700个蛋白点,其中超过90%的蛋白点的分布和相对强度基本一致。与前鞭毛体比较,6个蛋白点在无鞭毛体蛋白中明显高表达,3个蛋白点低表达。6个明显高表达的蛋白点中有5个为已知功能蛋白,分别为Reiske铁硫蛋白前体、α微管蛋白、过氧化物酶1、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶前体和甘露糖-1-磷酸瓜氨酸转移酶;3个低表达的蛋白点中有2个为已知功能蛋白,分别为热休克蛋白70和β微管蛋白。这些差异调节表达蛋白与碳水化合物/能量代谢,应激反应,细胞膜和细胞骨架形成相关。结论前鞭毛体与无鞭毛体蛋白质的表达存在差异。

关键词：杜氏利什曼原虫前鞭毛体无鞭毛体比较蛋白质组学

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的克隆及表达

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生物医学工程学杂志 2009年第4期26卷 820-824页

作者：陈宪陈建平徐佳楠王昕路睿芦殿香胡孝素四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫教研室成都610041 四川大学国家生物材料工程研究中心成都610041

构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中进行表达。从杜氏利什曼原虫基因组DNA中扩增无鞭毛体蛋白基因并用SOSUI和Tmpred方法预测其跨膜区结构;根据跨膜区预测的结果,... 详细信息

构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白N端胞外区基因(ast1)的原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中进行表达。从杜氏利什曼原虫基因组DNA中扩增无鞭毛体蛋白基因并用SOSUI和Tmpred方法预测其跨膜区结构;根据跨膜区预测的结果,扩增基因ast1并将其连接到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒命名为pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和免疫印迹分析表明,在约27kDa处获得重组目的蛋白rAST1的表达,显示成功构建杜氏利什曼原虫原核表达重组质粒pET32a(+)-ast1,并在大肠杆菌BL21中获得有效表达。

关键词：杜氏利什曼原虫无鞭毛体强白基因 ast1基因

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒的免疫原性研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2011年第2期29卷 122-125页

作者：李金福陈建平田玉杨志伟马莹胡孝素贵阳医学院寄生虫学教研室贵阳550004 四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教研室成都610041

目的研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性。方法将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只。两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+)(50μg/只),2周后同法加强免疫... 详细信息

目的研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性。方法将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只。两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+)(50μg/只),2周后同法加强免疫1次。加强免疫后第7、14和21天每组各取小鼠3只,内眦采血,分离血清,间接ELISA法测定血清中抗原特异性抗体水平。随后脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离脾细胞,用刀豆球蛋白A刺激培养,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-4的水平。结果加强免疫后第7、14和21天,实验组均检测到特异性IgG抗体,效价在1∶640以上,而对照组未检测到IgG抗体(P杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin免疫小鼠后可诱导其产生特异的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。

关键词：杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因疫苗免疫原性

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

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细胞与分子免疫学杂志 2007年第3期23卷 217-219,222页

作者：李金福陈建平杨志伟田玉马莹胡孝素四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教研室四川成都610041

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amas-tin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin,并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3.1(+)中,构... 详细信息

目的:构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amas-tin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin,并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法:提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3.1(+)中,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin。以pcDNA3.1-amastin转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3.1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果:在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-amastin成功地转入NIH3T3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后,用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因,表明获得了稳定表达。结论:成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒,并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。

关键词：杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因体外表达

杜氏利什曼原虫LACK基因真核表达重组质粒及其在真核细胞中的表达

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生物医学工程学杂志 2004年第2期21卷 272-275页

作者：马莹胡孝素王雅静卜玲毅四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教研室成都610041

利什曼原虫的 L ACK抗原是利什曼原虫活性蛋白激酶 C受体同源物 ,是一种新发现的抗原蛋白。我们以本实验室的重组质粒 T- L ACK为模板 ,PCR扩增获得 L ACK基因 ,与真核表达载体 pc DNA3.1(+)定向重组 ,重组质粒经酶切和 PCR分析 ,含有约... 详细信息

利什曼原虫的 L ACK抗原是利什曼原虫活性蛋白激酶 C受体同源物 ,是一种新发现的抗原蛋白。我们以本实验室的重组质粒 T- L ACK为模板 ,PCR扩增获得 L ACK基因 ,与真核表达载体 pc DNA3.1(+)定向重组 ,重组质粒经酶切和 PCR分析 ,含有约 95 0 bp的 L ACK基因 ,成功构建含有 L ACK基因的真核表达重组质粒 pc D-NA3- L ACK。将此重组质粒转染 COS- 7细胞 ,通过 RT- PCR及免疫荧光检测 L ACK基因在真核细胞中的表达。实验结果显示转染了重组质粒的 COS- 7细胞 ,其 RT- PCR及免疫荧光检测均呈阳性反应 ,证实重组质粒 pc DNA3-L ACK能在 COS- 7细胞中有效表达 L ACK蛋白。

关键词：杜氏利什曼原虫 LACK基因真核表达重组质粒真核细胞免疫荧光基因表达

杜氏利什曼原虫中国山丘疫区分离株磷脂多糖1(LPG1)基因及两侧非编码区序列的获取及分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2010年第6期28卷 465-467页

作者：陆小军严可宁简君杜晓青马莹四川大学华西医院实验医学科成都610041

通过PCR技术获得杜氏利什曼原虫中国山丘疫区分离株磷脂多糖1(LPG1)基因上游序列约2.2 kb,对该序列测序,根据测得序列设计引物,以染色体步移技术获得该序列下游约2 kb的核苷酸序列。将上述所获的2个序列拼接获得杜氏利什曼原虫中国山丘... 详细信息

通过PCR技术获得杜氏利什曼原虫中国山丘疫区分离株磷脂多糖1(LPG1)基因上游序列约2.2 kb,对该序列测序,根据测得序列设计引物,以染色体步移技术获得该序列下游约2 kb的核苷酸序列。将上述所获的2个序列拼接获得杜氏利什曼原虫中国山丘疫区分离株LPG1基因及其两侧非编码区核苷酸序列4 121 bp(GenBank登录号为HMO27899)。该序列与GenBank中相关序列进行序列一致性分析,结果显示,LPG1基因与多种利什曼原虫LPG1基因的核苷酸序列一致性为72%～78%。

关键词：杜氏利什曼原虫磷脂多糖染色体步移技术

杜氏利什曼原虫表达位点相关基因样蛋白的分子克隆及表达定位

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2014年第5期32卷 327-333页

作者：刘鹏张仁刚张洁敬保迁川北医学院免疫学与分子生物学研究所南充637000

目的克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)无鞭毛体特异表达新基因,观察其编码蛋白的亚细胞定位。方法制备杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体m RNA,以消减抑制杂交技术筛选无鞭毛体新的表达序列标签,扩增含有新表达序列标签的基因全... 详细信息

目的克隆杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)无鞭毛体特异表达新基因,观察其编码蛋白的亚细胞定位。方法制备杜氏利什曼原虫前鞭毛体和无鞭毛体m RNA,以消减抑制杂交技术筛选无鞭毛体新的表达序列标签,扩增含有新表达序列标签的基因全长c DNA,Northen杂交和RT-PCR检测新基因在前鞭毛体和无鞭毛体中的表达,共表达方法观察杜氏利什曼原虫内新基因编码蛋白的亚细胞定位。结果构建了杜氏利什曼原虫无鞭毛体表达序列标签消减文库,克隆到一个新基因,命名为表达位点相关基因样蛋白(ESAGLP)基因,其c DNA全长为2 258 bp,编码620 aa。ESAGLP基因仅在无鞭毛体内表达,其编码蛋白定位于线粒体。结论 ESAGLP鉴定为杜氏利什曼原虫无鞭毛体新基因,其编码蛋白定位于无鞭毛体的线粒体。

关键词：杜氏利什曼原虫 ESAG样蛋白表达定位消减抑制杂交

杜氏利什曼原虫平原和荒漠疫区分离株LACK基因克隆及序列分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2002年第4期20卷 197-200页

作者：马莹胡孝素王雅静王子龙四川大学华西基础医学和法医学院寄生虫学教研室成都610044

目的　测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。　方法　应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端... 详细信息

目的　测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。　方法　应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端终止法测序 ,并与 Gen Bank中相关数据进行比较。　结果　用 RT- PCR成功扩增出约95 0 bp的 L ACK基因片段 ,测序结果表明其片段大小均为 94 2 bp,与 Gen Bank中多种利什曼原虫 L ACK基因的核苷酸序列一致性达 97%以上。我国山丘、平原和荒漠 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因序列的一致性达95 %以上。　结论　获得了我国平原和荒漠疫区杜氏利什曼原虫 L ACK基因序列。我国 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因具有高度同源性。

关键词：杜氏利什曼原虫荒漠疫区基因克隆序列分析平原疫区活性蛋白激酶C受体同源物对比分析

杜氏利什曼原虫葡萄糖转运蛋白LmGT1的生物信息学分析

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中国病原生物学杂志 2021年第10期16卷 1183-1186页

作者：李智慧杨斌斌潍坊医学院医学检验学院山东潍坊261053

目的运用生物信息学分析软件预测杜氏利什曼原虫葡萄糖转运蛋白LmGT1的蛋白结构和功能。方法从NCBI网站上获取杜氏利什曼原虫LmGT1基因及编码LmGT1蛋白的基本信息,利用Ex-pasy网站Proparam、Proscale、STRING、TMHMM和SWISS MODEL等在... 详细信息

目的运用生物信息学分析软件预测杜氏利什曼原虫葡萄糖转运蛋白LmGT1的蛋白结构和功能。方法从NCBI网站上获取杜氏利什曼原虫LmGT1基因及编码LmGT1蛋白的基本信息,利用Ex-pasy网站Proparam、Proscale、STRING、TMHMM和SWISS MODEL等在线分析工具对葡萄糖转运蛋白LmGT1的生物信息学进行预测及分析。结果葡萄糖转运蛋白LmGT1基因全长为1 962 bp,有12个开放阅读框架,相对分子质量为70.716 52×10^(3),分子式为C_(3171)H_(4901)N_(823)O_(918)S_(46),原子总数为9 859,等电点5.91,为稳定的疏水性蛋白。LmGT1蛋白跨膜螺旋数为12,可能为跨膜蛋白。LmGT1蛋白包含59个磷酸化位点,无保守域;二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲占比分别为37.52%、16.39%、3.52%和42.57%;可能含有17个B细胞抗原表位(>0.85)和34个T细胞抗原表位(≥15);含有34个CTL细胞抗原决定簇(≥21),无Th细胞抗原决定簇。结论葡萄糖转运蛋白LmGT1含有多个可能的B细胞和T细胞抗原表位,可作为杜氏利什曼原虫致病性、感染预防与治疗及疫苗开发的研究靶点。

关键词： LmGT1 杜氏利什曼原虫葡萄糖转运蛋白生物信息学分析