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亚洲棉(+)-δ-杜松烯合成酶基因CAD1-A的分离及其在幼苗中的表达特征分析

中国科学（C辑） 2000年第2期30卷 145-152,T001页

作者：梁婉琪谭晓萍陈晓亚 T. Hashimoto Y. Yamada R. Heinstein 中国科学院上海植物生理研究所 Nara Institute of Science and Technology ara Institute of Science and Technology Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology Purdue University

棉花倍半萜环化酶，即（＋）－δ－杜松烯合成酶（ＣＡＤ），由一个基因家族编码．该基因家族可分为两个亚族：ＣＡＤ１－Ａ和ＣＡＤ１－Ｃ．分离了亚洲棉ＣＡＤ１－Ａ基因．对亚洲棉７天龄幼苗的ｍＲＮＡ原位杂交表明，ＣＡＤ１－Ａ... 详细信息

棉花倍半萜环化酶，即（＋）－δ－杜松烯合成酶（ＣＡＤ），由一个基因家族编码．该基因家族可分为两个亚族：ＣＡＤ１－Ａ和ＣＡＤ１－Ｃ．分离了亚洲棉ＣＡＤ１－Ａ基因．对亚洲棉７天龄幼苗的ｍＲＮＡ原位杂交表明，ＣＡＤ１－Ａ和ＣＡＤ１－Ｃ的转录子主要分布在侧根原基、顶端分生组织和新生侧根的维管组织中，在幼苗下胚轴的原形成层和部分表皮、下表皮细胞中也有分布．ＣＡＤ１－Ａ启动子在转基因烟草中表现出相似的活性．组织化学实验发现，倍半萜醛类分布于侧根根尖的外层细胞以及地上部分的色素腺体中．ＣＡＤ１基因在亚洲棉幼苗中的表达特征，以及倍半萜醛类的分布特征，组成了棉花幼苗的化学防御体系。

关键词：棉花倍半萜环化酶杜松烯原位杂交 CAD1-A

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大肠杆菌中蛋白质乙酰化修饰调控杜松烯人工合成途径的机制研究

大肠杆菌中蛋白质乙酰化修饰调控杜松烯人工合成途径的机制研究

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作者：邵喜喜苏州大学

学位级别：硕士

萜类化合物（Terpenoids）是一类广泛应用于医药、保健和化妆品等行业的天然产物,具有巨大的商业价值。大肠杆菌已经被开发为底盘细胞用于工程化合成多种萜类化合物。转录和翻译水平的代谢调控模式在工程化生产中发挥着重要作用,然而翻... 详细信息

萜类化合物（Terpenoids）是一类广泛应用于医药、保健和化妆品等行业的天然产物,具有巨大的商业价值。大肠杆菌已经被开发为底盘细胞用于工程化合成多种萜类化合物。转录和翻译水平的代谢调控模式在工程化生产中发挥着重要作用,然而翻译后修饰水平调控对萜类生物合成的影响方面认识尚有欠缺。乙酰辅酶A是多种天然产物生物合成的关键前体,也是蛋白质乙酰化的主要供体。以乙酰辅酶A起始,通过表达外源甲羟戊酸（MVA）途径和杜松烯合成途径可在大肠杆菌中生物合成杜松烯。因此,研究依赖乙酰辅酶A的Nε-乙酰化修饰是如何影响外源途径在大肠杆菌底盘细胞内的生物合成是一项有意义的工作。本论文以大肠杆菌MG1655作为底盘细胞,围绕外源代谢途径的乙酰化修饰与杜松烯的产量之间的关联,探究蛋白质翻译后修饰对细胞内代谢网络的影响。主要研究内容和结果如下:1、Nε-乙酰化修饰相关突变菌株的构建和测试。筛选大肠杆菌中已知的Nε-乙酰化修饰相关基因,利用Red同源重组的方法,构建相应乙酰化突变株;将外源MVA途径表达质粒（pSNA）和杜松烯合成途径表达质粒（pTispA-CADC）转入已构建的突变株,考察以葡萄糖或甘油分别作为碳源时,杜松烯合成能力的变化。结果发现,缺失去乙酰化酶CobB或乙酸激酶AckA均能促进杜松烯的合成;以葡萄糖为底物时,AckA可能通过调控乙酰磷酸水平在杜松烯合成中发挥了更大的作用。2、杜松烯合成途径中关键代谢酶乙酰化修饰的检测。表达和纯化MVA途径下游部分（MvaK1、MvaK2、MvaD、IDI）和杜松烯合成途径（IspA、CADC）蛋白,利用Western blot和LC-MS/MS检测分析上述蛋白质乙酰化修饰的发生情况以及乙酰化修饰位点。结果表明,此6个蛋白均能被大肠杆菌乙酰化修饰系统修饰,通过检测乙酰化突变株和出发菌株中MVA途径下游部分蛋白质乙酰化水平发现,敲除AckA突变株中,MVA途径下游部分蛋白质乙酰化修饰与对照相比明显增加,暗示MVA途径下游部分蛋白质乙酰化水平可能受到乙酰磷酸积累的调控。3、乙酰化修饰相关CobB、AckA突变体中杜松烯的合成和代谢网络变化分析。杜松烯合成受到培养基中酵母提取物浓度的影响。*** MGΔcobB和*** MGΔackA菌株在给定的条件下,杜松烯产量和MVA转化率随时间增长,呈现不同变化趋势,出发菌株*** MG1655和*** MGΔcobB的MVA转化率比*** MGΔackA表现出更快的下降趋势。MVA途径下游部分代谢酶在36 h时表现为更显著的乙酰化修饰水平。随之选取摇瓶培养30 h的工程菌株考察了各种菌株转录组变化情况。结果表明,*** MGΔackA菌株有显著性上调基因有180个,主要涉及到翻译、三羧酸（TCA）循环和糖代谢过程等生物学过程,而*** MGΔcobB菌株中几乎未检测到差异表达基因,达到显著性上调的基因只有3个。因此,*** MGΔcobB与*** MGΔackA中杜松烯合成性能的提升是由不同调控途径引起的。AckA参与的非酶促乙酰化修饰是大肠杆菌内乙酰化修饰的主要方式,它直接参与代谢活动或间接影响调控因子及代谢酶的功能,而CobB更可能是直接对关键代谢酶直接施加影响。综上所述,本论文发现杜松烯合成途径中关键代谢酶能被大肠杆菌Nε-乙酰化系统修饰。修饰相关酶AckA或CobB缺失对杜松烯合成呈现出增强的作用,两种酶可能通过不同调控机制参与调节外源杜松烯合成途径,增强其与底盘细胞的适配性。

关键词：大肠杆菌蛋白质乙酰化修饰杜松烯酶促/非酶促乙酰化萜类化合物

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入侵植物紫茎泽兰中杜松烯等倍半萜类防御物质及其生物合成研究

入侵植物紫茎泽兰中杜松烯等倍半萜类防御物质及其生物合成研究

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中国第九届植物化感作用学术研讨会

作者：刘燕骆世洪华娟李德森黎胜红中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室沈阳农业大学生物科学技术学院

外来入侵植物紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)是我国面临的重大生态灾害物种之一,严重破坏了我国大部分地区的生物多样性。该植物之所以难以彻底防治,除了因为它本身具有强大的繁殖力、旺盛的生命力和广泛的生态适应性外,还与... 详细信息

外来入侵植物紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)是我国面临的重大生态灾害物种之一,严重破坏了我国大部分地区的生物多样性。该植物之所以难以彻底防治,除了因为它本身具有强大的繁殖力、旺盛的生命力和广泛的生态适应性外,还与其成功的化学防御有密切的关系。紫茎泽兰含有丰富的次生代谢产物,特别是萜类和酚类化合物,它们都是潜在可能的防御性物质。我们采用GC-MS和HPLC技术分别分析了机械损伤、病原菌侵染、昆虫取食后,紫茎泽兰中挥发性和非挥发性次生代谢产物的变化。结果发现未被诱导植物释放的挥发性次生代谢产物比较少,主要为脂肪类化合物。机械损伤诱导紫茎泽兰叶片后,大量的挥发性次生代谢产物被释放出来,主要为倍半萜类化合物,占总挥发物的56.0%,其中杜松烯类倍半萜amorph-4-en-7-ol为总挥发物的11.6%。紫茎泽兰叶片在被链格孢菌侵染和棉铃虫取食诱导后,释放的挥发性次生代谢产物种类与机械损伤诱导较为相似,同样以倍半萜类成分为主,分别占72.6%和63.6%。此外,紫茎泽兰叶片在被机械损伤、链格孢菌侵染和棉铃虫取食诱导后,4个非挥发性化合物含量发生了明显变化。进一步通过跟踪分离结合NMR技术鉴定这4个化合物为杜松烯类倍半萜9-oxo-10,11-dehydroageraphorone、2,7-deoxo-3,4,6,11-tetradehydrocadinanene、9-oxo-ageraphorone和9β-hydroxy-ageraphorone。对部分挥发性倍半萜和4个非挥发性倍半萜进行了棉铃虫的拒食活性研究,发现这些化合物对棉铃虫均具有明显的拒食活性,EC50为2.52～9.18μg/cm2,表明杜松烯类等倍半萜是紫茎泽兰的主要化学防御物质。另外,我们从紫茎泽兰中克隆并功能鉴定了3个倍半萜合酶EaTPS1-3,其中EaTPS1的酶活产物通过萜类代谢途径改造的大肠杆菌工程细胞发酵液分离并利用NMR技术鉴定为amorpha-4,7(11)-diene,EaTPS2的酶活产物为(E)-α-bergamotene,(Z)-β-farnesene,γ-curcumene和β-sesquiphellandrene,而EaTPS3被鉴定为(E)-nerolidol合酶。q RT-PCR分析发现EaTPS1在嫩茎和叶中的表达量较高,而GC-MS分析发现amorpha-4,7(11)-diene主要积累在花和花芽中,推测嫩茎和叶中的amorpha-4,7(11)-diene可能被迅速转化为下游的杜松烯类倍半萜。EaTPS2主要在嫩茎中表达,EaTPS3主要在花中表达。进一步在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中瞬时表达EaTPS1,结果发现转基因烟草除了能够合成amorpha-4,7(11)-diene外,还产生了另一个化合物,通过跟踪分离及NMR技术鉴定其结构为amorph-4-en-7-ol,推测EaTPS1在烟草中可能具有合成amorpha-4,7(11)-diene和amorph-4-en-7-ol的功能,或者EaTPS1的产物amorpha-4,7(11)-diene可能被烟草中的氧化酶进一步氧化成amorph-4-en-7-ol。拒食活性分析发现,瞬时表达EaTPS1烟草叶片的拒食率为对照组的37.31±7.4%,且化合物amorpha-4,7(11)-diene和amorph-4-en-7-ol的EC50分别为4.28和4.10μg/cm2。该研究结果表明EaTPS1参与紫茎泽兰中杜松烯类倍半萜防御物质的生物合成,从化学水平和分子水平揭示了紫茎泽兰的防御机制,为紫茎泽兰的综合防治和利用提供了科学依据。

关键词：化学防御紫茎泽兰倍半萜杜松烯倍半萜合酶生物合成

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