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赤羽病病毒Gc aa465~704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

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中国兽医杂志 2023年第12期59卷 49-53页

作者：魏方陈冬杰邓俊花王晶晶吴绍强中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫研究所北京亦庄100176

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后... 详细信息

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc aa465~704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。

关键词：赤羽病病毒 Gc蛋白杆状病毒表达单克隆抗体

表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组杆状病毒构建与鉴定

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中国动物传染病学报 2023年

作者：王安铖李俊波胡一帆孟鑫陈玲超童武单同领于海孔宁刘雪兰童光志徐家萍郑浩东北林业大学野生动物学院安徽农业大学生命科学学院中国农业科学院上海兽医研究所安徽农业大学动物医学院

为了制备高活性的非洲猪瘟病毒p72蛋白，本文优化合成了非洲猪瘟B646L和B602L全基因序列，并分别克隆进pFastBac Dual载体中，构建了重组质粒pBac-B602L-B646L。将pBac-B602L-B646L转化感受态细胞DH10Bac中，经过蓝白斑纯化和PCR鉴定，... 详细信息

为了制备高活性的非洲猪瘟病毒p72蛋白，本文优化合成了非洲猪瘟B646L和B602L全基因序列，并分别克隆进pFastBac Dual载体中，构建了重组质粒pBac-B602L-B646L。将pBac-B602L-B646L转化感受态细胞DH10Bac中，经过蓝白斑纯化和PCR鉴定，获得重组杆状质粒rBacmid-p72。将rBacmid-p72转染到sf9昆虫细胞中，获得重组杆状病毒。通过IFA和western bolting分析，证实rBac-p72感染sf9表达p72和pB02L。以rBac-p72感染悬浮培养的sf9细胞，并通过Ni柱亲和层析获得了纯化的p72蛋白。以p72蛋白包被酶标板，通过间接ELISA检测，显示纯化的p72蛋白能与ASFV阳性血清中的抗体良好结合。上述研究结果表明，本文通过杆状表达的p72蛋白具有较高的活性，为下一步开展p72蛋白功能及应用研究打下良好的基础。

关键词：非洲猪瘟病毒杆状病毒表达 p72蛋白抗原性

小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

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实验动物科学 2023年第4期40卷 28-33页

作者：马畅赵迎峰陈莉刘彪赵志刚恽时锋中国人民解放军东部战区总医院医疗保障中心实验动物室全军实验动物科普与伦理教育基地全国科普教育基地南京210002 中国人民解放军东部战区总医院第三派驻门诊部南京210002

目的利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白,并对其免疫原性分析。方法将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒,提取重组杆粒经PCR... 详细信息

目的利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白,并对其免疫原性分析。方法将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒,提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后,用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后,可成功表达MVM VP2重组蛋白,经Western blot和IFA检测分析,重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性,为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。

关键词：小鼠细小病毒 VP2蛋白杆状病毒表达

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析

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大连海洋大学学报 2021年第3期36卷 393-398页

作者：孟少东姜新宇葛恒胡光耀杨大佐张家林李强大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室辽宁大连116023 盐城工学院海洋与生物工程学院江苏盐城224051

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9... 详细信息

为进一步研究鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)ORF4蛋白的功能,通过PCR扩增CyHV-2 ORF4基因,并构建重组穿梭质粒pFastBac HTA-ORF4,将其转化至大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞后获得重组杆粒Bacmid-ORF4;采用脂质体法转染Sf9细胞后,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白,采用His亲和层析柱纯化重组蛋白,并通过小鼠免疫试验分析其免疫原性。结果表明:转染72 h后Sf9细胞逐渐呈现出细胞变圆、细胞核明显增大的形态变化;间接免疫荧光结果显示,重组杆状病毒感染的Sf9细胞中出现了明显的绿色荧光;Western blot结果显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能够与抗His单抗发生特异性反应;小鼠免疫试验显示,纯化的CyHV-2 ORF4蛋白能诱导小鼠产生特异性免疫反应。研究表明,本研究中获得的CyHV-2 ORF4蛋白有较好的免疫原性,为CyHV-2 ORF4蛋白的功能解析提供了良好材料。

关键词：鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2) 杆状病毒表达 ORF4蛋白免疫原性

牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性

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中国兽医科学 2014年第9期44卷 915-920页

作者：姜良黄秀芬王天坤刘杉杉李永清北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097 吉林农业大学生物学院吉林长春130118 昌平区动物疫病预防控制中心北京102200

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pF... 详细信息

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pFB-gE转化到杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,制备重组杆粒rBacmid-gE。将该重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9,获得与gE基因发生重组的杆状病毒。Western-blot分析及间接免疫荧光试验(IFA)的结果显示,重组杆状病毒在Sf9中表达了分子质量大小约为43ku的gE融合蛋白,该融合蛋白分别与小鼠抗His标签单克隆抗体和小鼠抗BHV 1多克隆抗体发生特异性结合,表明获得的gE融合蛋白具有良好的免疫反应性。本研究为进一步获得高特异性的诊断抗原奠定了基础。

关键词：牛疱疹病毒1型 gE基因胞外区杆状病毒表达

重组猪肺表面活性蛋白A在昆虫杆状病毒表达系统的表达及体外抗PRRSV活性初步鉴定

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中国农业大学学报 2017年第4期22卷 101-108页

作者：李兰郑其升张元鹏李鹏成肖希龙付言峰侯继波江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 中国农业大学动物医学院北京100193 江苏省农业科学院畜牧研究所南京210014

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆... 详细信息

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca^(2+)时30μg/mL RpSP-A抑制率高达77%,15μg/mL RpSP-A抑制率为43%,未补加Ca^(2+)时RpSP-A没有表现出抑制作用。上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A。

关键词：猪表面活性蛋白A 杆状病毒表达猪繁殖与呼吸综合征病毒抗病毒活性

非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

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中国预防兽医学报 2012年第1期34卷 33-36页

作者：侯绍华柏丽华郭晓宇贾红姜一曈朱鸿飞中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物医学研究室北京100193

为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Ba... 详细信息

为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p72蛋白杆状病毒表达抗原性

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

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中国预防兽医学报 2005年第6期27卷 479-482页

作者：刘长明陆月华张超范危艳武刘焕章童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证。重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL。采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%。免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白杆状病毒表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建

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华北农学报 2009年第1期24卷 83-86页

作者：赵娜田宏吴锦艳满自萍尚佑军何生虎刘湘涛中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 宁夏大学农学院宁夏银川750021

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5... 详细信息

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因克隆杆状病毒表达