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应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒

第二军医大学学报 2011年第2期32卷 134-138页

作者：范丽徐增辉金华君徐凤青丁娜严淋钱其军浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所杭州310018 第二军医大学东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室上海200438

目的建立应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的技术体系,并初步检测所制备病毒的感染活力。方法采用杆状病毒生产系统包装rAAV8-EGFP,经高效液相色谱法提取并纯化病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度,通过观... 详细信息

目的建立应用杆状病毒系统制备8型腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的技术体系,并初步检测所制备病毒的感染活力。方法采用杆状病毒生产系统包装rAAV8-EGFP,经高效液相色谱法提取并纯化病毒,实时荧光定量PCR测定病毒滴度,通过观察绿色荧光蛋白的表达强度来检测rAAV8-EGFP对HEK-293细胞的感染活力。结果实时荧光定量PCR显示成功制备高滴度rAAV8-EGFP,滴度可达1.5×1012vg/ml,100ml摇瓶共得到1.5×1013vg rAAV8-EGFP病毒颗粒;感染后的HEK-293细胞具有较强的绿色荧光蛋白表达。结论应用杆状病毒系统成功制备高滴度、高活力的重组腺相关病毒,为后续研究奠定了基础。

关键词：杆状病毒系统腺相关病毒昆虫细胞

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中华蜜蜂溶血肽基因在杆状病毒系统中的表达

昆虫学报 2006年第1期49卷 16-21页

作者：施婉君张传溪程家安浙江大学应用昆虫学研究所

构建含中华蜜蜂溶血肽基因的重组转移载体pBacHT_GFPTAccM,转化受体菌DH10Bac,得重组穿梭载体Bacmid_GFPTAccM,Lipofectin介导其基因组DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn_5B1_4。SDS_PAGE分析表明,感染重组杆状病毒Bacmid_GFPTAccM的细胞表达产物在约为34kD处出现特异性条带,其表达量约占细胞总蛋白的3%。Westernblotting和细胞表达时相动态分析证明中华蜜蜂溶血肽基因已在粉纹夜蛾细胞系Tn_5B1_4中进行了成功的表达。

关键词：中华蜜蜂溶血肽表达杆状病毒系统粉纹夜蛾细胞系

用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒全长结构基因的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2002年第4期16卷 354-356页

作者：张明程伊瑶刘崇柏毕胜利中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎室北京100052

目的　获取含有戊型肝炎病毒 (HEV)全长结构基因的重组杆状病毒 ,表达戊型肝炎病毒结构蛋白。方法　将HEV全长结构基因 (5 14 7～ 712 6nt)插入杆状病毒表达载体pAcUW5 1,与线性化杆状病毒DNA(BaculoGoldDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,挑病毒... 详细信息

目的　获取含有戊型肝炎病毒 (HEV)全长结构基因的重组杆状病毒 ,表达戊型肝炎病毒结构蛋白。方法　将HEV全长结构基因 (5 14 7～ 712 6nt)插入杆状病毒表达载体pAcUW5 1,与线性化杆状病毒DNA(BaculoGoldDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,挑病毒斑进一步感染Sf9细胞 ,用SDS PAGE ,WesternBlot及免疫荧光检测戊型肝炎病毒结构蛋白的表达及活性。结果　SDS PAGE分析表明HEV结构基因在杆状病毒系统中高效表达 ,有相对分子质量约为 730 0 0和 6 30 0 0两种形式 ;WesternBlot及免疫荧光检测证明表达产物可与HEV阳性血清特异反应 ,说明具有HEV特异抗原性。结论　应用杆状病毒表达系统成功表达了HEV结构蛋白。

关键词：戊型肝炎病毒杆状病毒系统戊型肝炎基因表达重组戊型肝炎结构蛋白

猪传染性胃肠炎S基因A D抗原位点在昆虫杆状病毒系统中的表达

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中国兽医杂志 2006年第8期42卷 22-24页

作者：张炳丽唐丽杰范京慧王玉玲边亚娟钟涛李一经东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为主要临床症状的高度接触性传染病.该病对2周龄以内的仔猪具有高度致病性,致死率高达100%,是威胁养猪业发展的重要... 详细信息

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为主要临床症状的高度接触性传染病.该病对2周龄以内的仔猪具有高度致病性,致死率高达100%,是威胁养猪业发展的重要传染病.

关键词：猪传染性胃肠炎病毒杆状病毒系统抗原位点 S基因接触性传染病昆虫 AD 养猪业发展

猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒系统中的表达及纯化

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中国兽医杂志 2019年第2期55卷 31-35,38,I0004页

作者：牛康徐璐张乾义夏应菊朱元源邹兴启李翠赵启祖王琴中国兽医药品监察所国家/OIE猪瘟参考实验室

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数... 详细信息

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。

关键词：猪瘟病毒 E^rns蛋白杆状病毒系统间接ELISA

新城疫病毒F_(48)E_8株 HN基因在杆状病毒系统中表达

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中国生物制品学杂志 2002年第6期15卷 334-336页

作者：李太元殷震金宁一丁壮王兴龙延边大学农学院动物医学系龙井133400 中国人民解放军军需大学研究所长春130062

目的采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭... 详细信息

目的采用新型杆状病毒表达系统(Bac to Bac系统)在昆虫细胞Sf-9中进行新城疫病毒F48 E8株HN基因表达。方法NDV F48 E8株 HN基因插入到转座载体 pFast Bac Ⅰ,构建重组转座载体 pFast HN,转化到感受态细胞 DH10后,将目的基因转座到穿梭载体Bacmid中,经筛选获得重组Bacmid HN转染到Sf-9昆虫细胞,并进行检测。结果表达产物经SDS-PAGE、Westem blot检测获得蛋白特异带,相对分子质量约63000。结论NDVF48E8株HN基因能通过新型杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf-9中进行表达,表达量约为细胞总蛋白的10％。

关键词：新城疫病毒F48E8株 HN基因杆状病毒系统表达

马巴贝西虫EMA-1蛋白基因在杆状病毒系统中的表达

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中国兽医杂志 2004年第11期40卷 14-15页

作者：张守发鞠玉琳贾洪林延边大学农学院吉林龙井133400

马巴贝西虫(Babesia equi)是一种蜱传播的血液寄生原虫.马巴贝西虫裂殖子抗原EMA-1,是B.equi的一种主要的表面蛋白,基因长度为816 bp,由272个氨基酸组成,分子量为34 kDa,具有较强的免疫原性和特异性,被认为具有广泛的开发前景.本文利用... 详细信息

马巴贝西虫(Babesia equi)是一种蜱传播的血液寄生原虫.马巴贝西虫裂殖子抗原EMA-1,是B.equi的一种主要的表面蛋白,基因长度为816 bp,由272个氨基酸组成,分子量为34 kDa,具有较强的免疫原性和特异性,被认为具有广泛的开发前景.本文利用杆状病毒真核表达系统对B.equi的EMA-1基因进行了体外表达,为进一步研究EMA-1的结构和功能,研制重组诊断抗原奠定基础.

关键词：马巴贝西虫血液寄生原虫 EMA-1蛋白基因杆状病毒系统表达免疫原性

狂犬病病毒核蛋白在Bac—To—Bac／AcMNPV杆状病毒系统的表达

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今日畜牧兽医 2010年第3期26卷 68-68页

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白，本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因．将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中，构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞，得到重组穿梭质粒reBacmid—NP；通过转染昆虫细胞sf9... 详细信息

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白，本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因．将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中，构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞，得到重组穿梭质粒reBacmid—NP；通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。

关键词： AcMNPV 狂犬病病毒核蛋白基因杆状病毒系统 Bac 杆状病毒转移载体 PCR克隆重组杆状病毒

维普期刊数据库评论

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牛γ干扰素的表达及其抗病毒活性测定

生物工程学报 2011年第2期27卷 269-276页

作者：徐正中陈祥单锋丽孟闯孙林黄金林潘志明耿士忠焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室扬州225009

通过RT-PCR从经ConA刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛γ干扰素(BoIFN-γ)cDNA,克隆到真核载体pVAX1中,测序结果显示pVAX1中的插入序列BoIFN-γ基因与已报道序列一致。用重组质粒pVAX1-BoIFN-γ转染COS-7细胞并进行间接免疫荧... 详细信息

通过RT-PCR从经ConA刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛γ干扰素(BoIFN-γ)cDNA,克隆到真核载体pVAX1中,测序结果显示pVAX1中的插入序列BoIFN-γ基因与已报道序列一致。用重组质粒pVAX1-BoIFN-γ转染COS-7细胞并进行间接免疫荧光试验鉴定,结果显示BoIFN-γ在COS-7细胞中得到成功表达。将BoIFN-γ基因克隆到原核表达质粒pET-30a(+)、pGEX-6p-1后,分别转化重组表达菌BL21(DE3)、BL21后,通过对表达条件的优化,SDS-PAGE分析表明两种重组蛋白均可实现可溶性表达,大小分别为23 kDa和43 kDa。将含信号肽BoIFN-γ基因克隆到转座载体pFastBacTM1中并转化DH10Bac,通过位点特异性转座将BoIFN-γ基因整合到穿梭载体Bacmid中并通过脂质体转染Sf9昆虫细胞,产生重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ,重组病毒传代扩增感染Sf9细胞后,通过间接免疫荧光试验证实BoIFN-γ在杆状病毒系统中获得表达。使用MDBK/VSV细胞系统测定rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ以及rBac-BoIFN-γ的抗病毒活性,其效价分别达到8.389×107 U/mg、6.554×105 U/mg、4.096×104 U/mL,3种具有较高的抗病毒活性重组牛γ干扰素的获得为其开发应用提供了重要的生物材料。同时使用单克隆抗体5G4和3E6,建立了BoIFN-γ的双抗夹心ELISA检测方法并绘制了标准曲线,可定量分析BoIFN-γ的抗病毒活性,为其临床应用及相关研究提供了重要的方法。

关键词：牛γ干扰素大肠杆菌系统杆状病毒系统抗病毒活性 ELISA