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多巴胺D1受体在Sf9昆虫细胞中的表达及左旋氯代斯阔任对重组D1受体的激动作用(英文)

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Acta Pharmacologica Sinica 2003年第3期24卷 35-39页

作者：和友金文桥申庆祥陈新建金国章上海 200032 中国上海市计划生育研究所上海市计划生育研究所上海 200031 中国科学院上海生命科学研究院药物研究所

目的:在Sf9昆虫细胞中表达D1受体,并研究左旋氯代斯阔任对重组D1受体的激动作用。方法:构建含D1受体cDNA的重组杆状病毒,以其感染Sf9昆虫细胞得到D1受体表达。[~3H]SCH23390受体结合检测重组D1受体的药理特性。[~3H]SCH23390受体结合和c... 详细信息

目的:在Sf9昆虫细胞中表达D1受体,并研究左旋氯代斯阔任对重组D1受体的激动作用。方法:构建含D1受体cDNA的重组杆状病毒,以其感染Sf9昆虫细胞得到D1受体表达。[~3H]SCH23390受体结合检测重组D1受体的药理特性。[~3H]SCH23390受体结合和cAMP测定实验检测左旋氯代斯阔任对重组D1受体的激动作用。结果:在Sf9昆虫细胞中成功表达D1受体,[~3H]SCH23390与重组D1受体最大结合量(Bmax)为(0.94±0.06)nmol/g蛋白,[~3H]SCH23390与重组D1受体的结合解离常数(Kd)为(1.9±0.3)nmol/L,其药理特性与小牛纹状体脑匀浆所得结果一致。左旋氯代斯阔任对重组D1受体有高亲和力,解离常数Ki为(6.3±1.4)nmol/L;并剂量依赖地引起胞内cAMP增加,EC50为0.72μmol/L(95％可信限为0.67-0.77μmol/L),表现出D1激动作用。结论:在杆状病毒/昆虫细胞Sf9中,成功建立了D1受体异源表达系统。在细胞分子水平,直接证实了左旋氯代斯阔任对D1受体的激动作用。

关键词：重组蛋白质类多巴胺D1受体昆虫杆状病毒科左旋氯代斯阔任环腺苷一磷酸

人细胞色素P450 3A4突变体CYP3A4.3,CYP3A4.4,CYP3A4.5和CYP3A4.18重组酶的异源表达与活性

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中国药理学与毒理学杂志 2009年第6期23卷 456-463页

作者：王晓雯曾苏浙江大学药学院药物分析与药物代谢实验室浙江杭州310058

目的重组表达人细胞色素P450(CYP)3A4突变体CYP3A4.3,CYP3A4.4,CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白,为CYP3A4代谢活性的体外研究提供单一酶源。方法应用杆状病毒表达系统构建含有上述各CYP3A4突变体基因序列的重组病毒,将其连同含人源还原型烟酰... 详细信息

目的重组表达人细胞色素P450(CYP)3A4突变体CYP3A4.3,CYP3A4.4,CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白,为CYP3A4代谢活性的体外研究提供单一酶源。方法应用杆状病毒表达系统构建含有上述各CYP3A4突变体基因序列的重组病毒,将其连同含人源还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-P450氧化还原酶(POR)和细胞色素b5基因的重组病毒共同感染昆虫草地夜蛾细胞Sf9得到CYP3A4突变体与POR和细胞色素b5共表达的重组蛋白,分别以高效液相色谱法和荧光分析法测定各重组酶对睾酮和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素的代谢活性。结果在mRNA分子水平上验证了CYP3A4突变体CYP3A4*3,CYP3A4*4,CYP3A4*5和CYP3A4*18基因在Sf9细胞中的转录。感染了各重组病毒的Sf9细胞裂解液对睾酮和7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素有明显代谢。结论应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统在体外成功表达了具有催化活性的人CYP3A4突变体CYP3A4.3,CYP3A4.4,CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白,其中CYP3A4.5活性显著低于野生型蛋白,CYP3A4.18活性显著高于野生型蛋白,而CYP3A4.3和CYP3A4.4与野生型蛋白活性近似。

关键词：细胞色素P450CYP3A4 突变杆状病毒科睾酮

呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化

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中华实验和临床病毒学杂志 2009年第5期23卷 337-339页

作者：付远辉魏薇何金生郑娴娴王小波唐倩张梅屈建国洪涛北京交通大学生命科学与生物工程研究院 100044 安徽医科大学免疫学教研室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

目的研究人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial viruse，RSV）分泌型融合蛋白（secreted fusion protein，sV）基因在杆状病毒中的表达及纯化。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区... 详细信息

目的研究人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial viruse，RSV）分泌型融合蛋白（secreted fusion protein，sV）基因在杆状病毒中的表达及纯化。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列，获得COOH’端带有His标签的重组SF-His蛋白编码基因，利用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统，构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒，用脂质体Cellfeetine reagent转染sf9细胞，实现sF在sf9细胞中的表达，Ni柱亲和层析纯化sF蛋白。结果成功获得了sF-His编码基因，构建的重组杆状病毒可高效表达sF，Ni-柱纯化后sF的浓度为1．084mg／ml，纯度达90％以上。结论杆状病毒系统是制备sF的有效方法，纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础。

关键词：杆状病毒科呼吸道合胞病毒,人糖蛋白类

重组杆状病毒载体介导大鼠螺旋神经节细胞基因转染的研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2007年第12期42卷 939-942页

作者：王俊王士礼蔡昌枰李彪张一帆胡胜平田相龙张敏上海交通大学医学院附属瑞金医院耳鼻咽喉科 200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院核医学科 200025 上海交通大学医学院附属瑞金医院消化科 200025

目的探讨重组杆状病毒(baculovirus,Bac)作为内耳螺旋神经节细胞基因转染载体的可行性及其转染特点。方法应用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统制备携带绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的杆状病毒载体(Bac-GFP),以不同感染复数... 详细信息

目的探讨重组杆状病毒(baculovirus,Bac)作为内耳螺旋神经节细胞基因转染载体的可行性及其转染特点。方法应用 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统制备携带绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)的杆状病毒载体(Bac-GFP),以不同感染复数(multiplicities of infection,MOI)的病毒和不同浓度的丁酸钠转染大鼠螺旋神经节细胞,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞转染率和绿色荧光蛋白表达强度,并观察杆状病毒和丁酸钠对螺旋神经节细胞的毒性。结果杆状病毒可以高效转染螺旋神经节细胞,转染效率达77.69%。Bac-GFP 转染率和表达强度随着 MOI和丁酸钠浓度的提高而提高。GFP 在转染后6 h 开始表达,第2天达到最高。重组杆状病毒 MOI 小于800以及丁酸钠终浓度小于或等于10 mmol/L 时,对螺旋神经节细胞没有明显细胞毒性。结论重组杆状病毒可以在体外高效安全转染内耳螺旋神经节细胞。

关键词：螺旋神经节杆状病毒科转染

天蚕素B-黄体生成素释放激素结合部位重组基因的构建及其抑癌功能的研究

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中华妇产科杂志 2007年第7期42卷 477-481页

作者：李小永李荷莲郑桂英浙江大学医学院附属妇产科医院妇科杭州310006 吉林大学第二临床医院妇产科

目的构建天蚕素 B-黄体生成素释放激素结合部位(CB-LHRH')重组基因,探讨 CB-LHRH'蛋白成为新型抗肿瘤靶向药物的可能性。方法设计并人工合成 CB-LHRH′重组基因序列,应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达目的蛋白并通过蛋白斑点印迹法鉴定... 详细信息

目的构建天蚕素 B-黄体生成素释放激素结合部位(CB-LHRH')重组基因,探讨 CB-LHRH'蛋白成为新型抗肿瘤靶向药物的可能性。方法设计并人工合成 CB-LHRH′重组基因序列,应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达目的蛋白并通过蛋白斑点印迹法鉴定,采用二甲氧唑黄(XTT)比色法检测不同剂量的目的蛋白对卵巢上皮性癌细胞株 SKOV3(LHRH 受体阴性)和子宫内膜癌细胞株 HEC-1B(LHRH 受体阳性)细胞的生长抑制率,并进行镜下形态观察。结果蛋白斑点印迹法检测结果显示,重组杆状病毒感染的 Sf9细胞裂解液呈现棕色,证实 CB-LHRH'蛋白已表达。重组杆状病毒感染的昆虫细胞系 Sf9细胞裂解液对 SKOV3及 HEC-1B 细胞的生长抑制率,随作用时间的延长和剂量的增加而增加,SKOV3细胞的生长抑制率从(5.03±0.08)%增加至(53.24±1.22)%,HEC-1B细胞的生长抑制率从(5.13±0.37)%增加至(56.16±1.08)%。相同剂量的重组杆状病毒感染的 Sf9细胞裂解液,作用相同时间,其对 HEC-1B 细胞的生长抑制率高于 SKOV3细胞,差异有统计学意义(P杆状病毒感染的 St9细胞裂解液作用后,镜下可见癌细胞出现明显改变甚至成片坏死崩解为无定形的颗粒状物质。结论 CB-LHRH'蛋白可有效杀伤 LHRH 受体阳性的HEC-1B 细胞,有望成为治疗表达 LHRH 受体的肿瘤的抗肿瘤靶向药物。

关键词：抗生素类肽促性腺素释放激素重组遗传受体 LHRH 杆状病毒科细胞系肿瘤

利用昆虫—杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白

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中华实验和临床病毒学杂志 2001年第4期15卷 314-316页

作者：郑滨王健伟姜惠英屈建国王一礼司履生董小平西安医科大学西安710068 中国预防医学科学院病毒学研究所

目的　获得人乳头瘤病毒 16型 (Humanpapillomavirustype 16 ,HPV16 )L1蛋白。方法　以pFB1为载体构建HPV 16L1杆状病毒表达质粒 ,并感染昆虫细胞Sf 9结果　收集 2 7℃ ,培养 72h的感染重组病毒的Sf 9,提取细胞蛋白。经SDS PAGE蛋白电... 详细信息

目的　获得人乳头瘤病毒 16型 (Humanpapillomavirustype 16 ,HPV16 )L1蛋白。方法　以pFB1为载体构建HPV 16L1杆状病毒表达质粒 ,并感染昆虫细胞Sf 9结果　收集 2 7℃ ,培养 72h的感染重组病毒的Sf 9,提取细胞蛋白。经SDS PAGE蛋白电泳分析 ,发现有一相对分子质量为 5 6 0 0 0的蛋白表达 ,Westernblot证实所表达的蛋白为HPV16L1。结论　昆虫—杆状病毒表达系统可有效地表达HPV

关键词：人乳头状瘤病毒病毒蛋白质类杆状病毒科基因表达调控

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EBV-LMP2蛋白的表达和初步纯化

中华实验和临床病毒学杂志 2010年第3期24卷 168-170页

作者：王湛马晶周玲张晓光杜海军杨松梅曾毅中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室 100052 北京工业大学生命科学与生物工程学院

目的应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组... 详细信息

目的应用杆状病毒表达载体表达并纯化EB病毒LMP2蛋白.方法利用杆状病毒Bac-to-Bae杆状病毒表达系统,将EBV-LMP2基因插入到质粒pFastBacTMHT B中,获得携带EBV-LMP2基因的重组杆状病毒Bac-LMP2.重组病毒感染Sf-9细胞,表达N端携带6个组氨酸（6 X His）的LMP2融合蛋白His-LMP2.经镍离子亲和层析纯化,获得纯化蛋白.结果 SDS-PAGE及Western-Blot检测表达的蛋白相对分子质量大小与预计结果一致.HPLC分析纯化后蛋白的纯度可达86%.结论利用杆状病毒表达系统表达EB病毒LMP2基因并经过初步纯化后,可以获得较好纯度的LMP2蛋白.

关键词：基因,LMP2 杆状病毒科基因表达

森林脑炎病毒prM-E蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫活性测定

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第4期19卷 335-339页

作者：刘艳丽司炳银户义张雨杨银辉祝庆余军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的为了表达森林脑炎病毒prME蛋白,为森林脑炎快速诊断试剂的研制奠定基础。方法经过RTPCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,以杆状病毒昆虫细胞表达系统成功地表达了森林脑炎病毒MDJ01株prME蛋白。结果从感染细胞上... 详细信息

目的为了表达森林脑炎病毒prME蛋白,为森林脑炎快速诊断试剂的研制奠定基础。方法经过RTPCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,以杆状病毒昆虫细胞表达系统成功地表达了森林脑炎病毒MDJ01株prME蛋白。结果从感染细胞上清中电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,说明重组病毒感染细胞后产生病毒样表达颗粒(viruslikeparticlesVLPs),并且分泌至细胞外。免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的重组蛋白能够与抗森林脑炎病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性。ELISA和间接免疫荧光染色证实,重组prME蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在昆虫细胞中表达的prME具有良好的抗原性,本研究为森林脑炎快速特异诊断试剂研制奠定了基础。

关键词：脑炎病毒亚组,蜱传基因,prM-E 杆状病毒科表达的序列标记

H1N1亚型流感病毒NA基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定

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中华实验和临床病毒学杂志 2013年第2期27卷 81-84页

作者：姚立红付金奇陈爱珺刘晓宇徐鹏卫郭建强张乐翠中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 青岛农业大学动物科技学院

目的构建含有H1N1亚型流感病毒NA基因的重组杆状病毒。方法用PCR方法扩增甲型H1N1亚型流感病毒（A／PR8／34）全长神经氨酸酶基因，并将其连接于pFastBacdual载体，构建杆状病毒转移载体pFBD-NA。转化含有Bacmld的DHl0B感受态细胞后，... 详细信息

目的构建含有H1N1亚型流感病毒NA基因的重组杆状病毒。方法用PCR方法扩增甲型H1N1亚型流感病毒（A／PR8／34）全长神经氨酸酶基因，并将其连接于pFastBacdual载体，构建杆状病毒转移载体pFBD-NA。转化含有Bacmld的DHl0B感受态细胞后，获得重组穿梭载体rBacmid—NA。将其转染昆虫细胞sf9，获得重组病毒rBac—NA。提取重组杆状病毒rBac—NA的DNA并使用PCR方法检测；采用间接免疫荧光，SDS-PAGE，WesternBlot鉴定以及ELISA方法检测所表达的NA蛋白。结果经PCR鉴定所构建质粒rBacmid—NA正确；使用间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光位于感染细胞的表面，WesternBolt检测可与小鼠抗PR8株多克隆抗体和兔抗甲型流感病毒NA多克隆抗体发生特异性免疫反应；经ELISA检测，NA蛋白可被鼠抗流感病毒（PR8）多克隆抗体特异性识别。结论上述结果证明，我们获得了表达流感病毒NA蛋白的重组杆状病毒，为进一步研究NA蛋白的功能和新型流感疫苗的开发奠定了基础。

关键词：正黏病毒科神经氨酸酶杆状病毒科细胞,培养的