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杀雄剂sq-1诱导小麦雄性不育花粉粒差异蛋白质组学研究

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中国生物化学与分子生物学报 2009年第10期25卷 949-957页

作者：叶景秀张改生王书平陈蕊红王俊生牛娜马守才李红霞朱建楚西北农林科技大学陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室/小麦育种教育部工程研究中心杨凌712100

采用固相pH梯度/SDS-PAGE双向凝胶电泳对经杀雄剂sq-1处理和未处理的小麦(Triticum aestivum)成熟期花粉总蛋白质进行了分离,银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.通过PDQuest 2DE图像软件的分析,在等电点4～7之间可识别35... 详细信息

采用固相pH梯度/SDS-PAGE双向凝胶电泳对经杀雄剂sq-1处理和未处理的小麦(Triticum aestivum)成熟期花粉总蛋白质进行了分离,银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.通过PDQuest 2DE图像软件的分析,在等电点4～7之间可识别350个以上较为清晰的蛋白质点,其中差异表达明显的蛋白质点数为21个.将11个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行了肽质量指纹图谱分析,采用Mascot软件在Swiss-prot数据库查询,鉴定出了7个蛋白质,它们分别是液泡转化酶、动力蛋白轻链TCTEX-1、锰超氧化物歧化酶、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、抗坏血酸过氧化物酶、凝集素蛋白激酶和一种未知功能的蛋白.对已知蛋白的功能进行分析,推测杀雄剂sq-1诱导小麦雄性不育可能与能量代谢失衡、淀粉合成受抑制、活性氧积累、细胞凋亡以及花器官发育调节基因作用失控等有关.

关键词：小麦杀雄剂sq-1 花粉粒差异蛋白质组学双向电泳基质辅助激光解吸飞行时间质谱

杀雄剂sq-1诱导的小麦生理型雄性不育系交替氧化酶基因(AOX1)的表达分析

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麦类作物学报 2011年第5期31卷 805-810页

作者：李亚鑫盛英张改生宋瑜龙王亮明张龙雨王书平李莉西北农林科技大学陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室/小麦育种教育部工程研究中心陕西杨凌712100

为了揭示小麦生理型雄性不育败育过程与交替氧化酶(AOX1)基因表达的关系,利用荧光定量技术分析了小麦交替氧化酶基因家族AOX1基因(AOX1a和AOX1c)在K型遗传型不育系[ms(Kots)-90-110]、K型不育系和恢复系杂交后经多代回交选育的可育系(BC... 详细信息

为了揭示小麦生理型雄性不育败育过程与交替氧化酶(AOX1)基因表达的关系,利用荧光定量技术分析了小麦交替氧化酶基因家族AOX1基因(AOX1a和AOX1c)在K型遗传型不育系[ms(Kots)-90-110]、K型不育系和恢复系杂交后经多代回交选育的可育系(BC5F1)以及杀雄剂sq-1诱导的BC5F1小麦生理型雄性不育系的旗叶和花药(单核期、二核期、三核期)中的表达情况。结果表明,AOX1a基因在供试可育系(BC5F1)和遗传型不育系[ms(Kots)-90-110]中的表达规律一致,都表现为旗叶中的表达量较少,花药单核期表达量最高,二核期和三核期表达量下降;sq-1诱导的生理型不育系中AOX1a基因在旗叶中表达量也最少,花药单核期表达量最高,二核期表达量减少,但三核期略呈上升;与其他2个材料相比较,生理型不育系的单核期AOX1a基因的表达量极显著增加,二核期极显著降低。AOX1c基因在3个材料各时期的表达规律一致,都表现为先升后降;但在表达量上,可育系与生理型不育系各时期的表达量两者几乎没有差异,遗传型不育系中的单核期表达量极显著低于可育系和生理型不育系。推测,AOX1a基因在生理型不育系单核期和二核期的异常表达,可能影响了花药发育过程中抗氰呼吸途径,导致呼吸代谢紊乱,引起花药败育;AOX1c基因没有参与生理型不育的代谢调节。

关键词：小麦杀雄剂sq-1 AOX1基因荧光定量PCR

杀雄剂sq-1诱导小麦生理型雄性不育小花完整叶绿体差异蛋白质的鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第9期26卷 854-861页

作者：王书平张改生叶景秀李莉宋瑜龙王亮明代军军张龙雨牛娜马守才朱建楚西北农林科技大学陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室/小麦育种教育部工程研究中心杨凌712100 青海省农林科学院西宁810016

为了在蛋白质水平揭示小麦雄性不育的分子遗传机制,以小麦经杀雄剂sq-1诱导的生理型雄性不育系,以及对应正常可育系所构建的等生理差异系为试材,应用差速离心和蔗糖密度梯度离心,首先分离出供试材料小花的完整叶绿体,制备蛋白样品后采... 详细信息

为了在蛋白质水平揭示小麦雄性不育的分子遗传机制,以小麦经杀雄剂sq-1诱导的生理型雄性不育系,以及对应正常可育系所构建的等生理差异系为试材,应用差速离心和蔗糖密度梯度离心,首先分离出供试材料小花的完整叶绿体,制备蛋白样品后采用固相IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对完整叶绿体蛋白质进行了分离、银染,得到了重复性较好的双向电泳图谱.PDQuest2DE软件分析识别出约150个较为清晰的蛋白质点,采用MALDI-TOF鉴定出的6个差异表达蛋白质分别是:PAP-fibrillin、ATRABB1A、底物同源结构域蛋白/RhoGAP结构域蛋白、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、R2R3-MYB转录因子及1个假定蛋白质.生物信息学功能分析暗示,这些蛋白直接参与了花药内激素调节、蛋白质转运、蛋白质互作、活性氧积累及花药的发育,表明sq-1诱导的小麦生理型雄性不育其败育机理可能就与这些生理代谢过程的变异直接相关.

关键词：小麦杀雄剂sq-1 生理型雄性不育完整叶绿体差异蛋白质组学 2D-PAGE MALDI-TOF-MS

杀雄剂sq-1诱导小麦生理型雄性不育小花完整叶绿体差异蛋白质组学研究

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杀雄剂SQ-1诱导小麦生理型雄性不育小花完整叶绿体差异蛋白质组学...

作者：王书平西北农林科技大学

学位级别：硕士

化学杀雄技术打破了三系育种的束缚,使化控二系育种技术在生产上得到广泛应用。杀雄剂sq-1是我国自行研制的具有自主知识产权的一种新型小麦杀雄剂,正常发育的小麦经sq-1处理后,可得到95%-100%的不育株,异花授粉结实率高达85%以上,是目... 详细信息

化学杀雄技术打破了三系育种的束缚,使化控二系育种技术在生产上得到广泛应用。杀雄剂sq-1是我国自行研制的具有自主知识产权的一种新型小麦杀雄剂,正常发育的小麦经sq-1处理后,可得到95%-100%的不育株,异花授粉结实率高达85%以上,是目前国内稳定性较高的化学杂交剂。经过多年的生产实践,sq-1已经在小麦杂种优势利用上获得了一套成熟的技术,并不断培育出一些高产优质的小麦杂交种,如:西杂一号、西杂五号等。为了揭示小麦化学杀雄所导致的雄性不育机理,本研究以小麦三核期小花(去芒和外颍)为材料,在细胞器层次,以叶绿体蛋白质组分为主要研究对象,研究和分析了小麦经sq-1处理后所诱导的生理型雄性不育的分子机制,获得下述重要结果: (1)首先,应用两种蔗糖密度梯度分离体系,通过镜鉴和SDS-PAGE凝胶电泳比较分析了两种分离纯化完整叶绿体的方法,并在IPG胶条pH值范围和蛋白质上样量等方面对叶绿体蛋白质双向电泳体系进行了探索和优化,确立了一套适用于小麦小花完整叶绿体的分离及其蛋白质双向电泳的技术方法。即采用30%,45%,60%的不连续蔗糖密度梯度离心的方法能够获得完整且纯度较高的叶绿体,经TCA-丙酮提取蛋白质后,选用17cm,pH4的IPG线性胶条,在上样量为280μg/gel,13%SDS-PAGE胶浓度下进行双向凝胶电泳,蛋白质得到了更好的分离,2-DE图谱上可分辨出约150个蛋白点,为下一步利用双向电泳技术在亚细胞水平对叶绿体蛋白质组学的研究分析奠定了基础。 (2)应用差数离心及蔗糖密度梯度离心的方法,分离出小麦小花的完整叶绿体;采用固相IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对经杀雄剂sq-1处理和未处理的小麦小花完整叶绿体蛋白质进行了分离,银染显色,得到了重复性较好的双向电泳图谱。 (3)通过PDQuest 2DE软件分析,等电点在4～7范围内,可识别约150个较为清晰的蛋白质点,对6个差异表达蛋白质点采用MALDI-TOF肽指纹图谱分析,并结合Mascot软件在Swiss-prot数据库搜索,鉴定出的蛋白质分别是:PAP-fibrillin、ATRABB1A、底物同源结构域蛋白/Rho GAP结构域蛋白、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、R2R3-MYB转录因子及假定蛋白质,它们参与了花药内激素调节、蛋白质转运、蛋白互作、活性氧积累及花药的发育,sq-1诱导的小麦雄性不育可能与这些生理过程有关。

关键词：小麦杀雄剂sq-1 生理型雄性不育完整叶绿体双向电泳差异蛋白质 MALDI-TOF-MS

杀雄剂sq-1诱导的小麦生理型雄性不育系交替氧化物酶基因（AOX1）的表达分析

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杀雄剂SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育系交替氧化物酶基因（AOX1）...

作者：李亚鑫西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦是我国仅次于水稻的主要粮食作物,小麦杂种优势利用是提高小麦产量与品质的重要途径。小麦杂种优势的利用主要有以下三条途径,细胞质雄性不育、光温敏雄性不育和经过化学杀雄剂处理的生理型雄性不育。化学杀雄剂诱导小麦雄性不育是... 详细信息

小麦是我国仅次于水稻的主要粮食作物,小麦杂种优势利用是提高小麦产量与品质的重要途径。小麦杂种优势的利用主要有以下三条途径,细胞质雄性不育、光温敏雄性不育和经过化学杀雄剂处理的生理型雄性不育。化学杀雄剂诱导小麦雄性不育是目前小麦杂种优势利用的一条重要而简捷的途径,它最大的优点是可以把育种的起点建立在小麦常规育种的最新成果上。sq-1是一种新型的小麦杀雄剂,具有杀雄彻底、喷药窗口范围广、对小麦无不良影响等优点,是目前最优良小麦杀雄剂之一。目前,对其诱导的雄性不育机理的研究,虽在蛋白质与基因水平都取得了较大的进展,但对其具体的作用机理还尚未从本质上有所揭示。因此,本研究以ms(Kots)-90-110遗传型雄性不育系,经杀雄剂sq-1诱导的对应于ms(Kots)-90-110属近等可育基因系BCF的生理型雄性不育系,正常发育的BCF系为供试材料,以NCBI中已经公布的交替氧化酶基因家族AOX1(AOX1α和AOX1c)基因序列的保守区域设计实时荧光定量特异引物,进行实时荧光定量PCR分析,分析小麦交替氧化酶基因家族AOX1基因(AOX1α和AOX1c)在以杀雄剂sq-1诱导的小麦生理型雄性不育系,正常可育系和遗传型雄性不育系的旗叶和花药(单核期、二核期和三核期)中的表达情况,从而揭示小麦生理型雄性不育其败育过程与交替氧化酶(AOX1)基因表达的关系。从而,为进一步揭示小麦生理型雄性不育提供理论依据。经实验获得如下重要结果: 1.实时荧光定量分析了AOX1α基因在遗传型雄性不育系、生理型雄性不育系和正常可育系旗叶、单核期、二核期和三核期的表达情况,结果表明,AOX1α基因在供试可育系和遗传型等基因不育系中的表达规律一致,都表现为旗叶中的表达量较少,花药单核期表达量最高,二核期和三核期表达量下降;而sq-1诱导的生理型不育与前相同的是旗叶中表达量也是最少,花药单核期表达量最高,二核期表达量减少,但三核期略呈上升;与同期遗传型不育系和可育系比较,生理型不育系的单核期AOX1α基因的表达量极显著的增加,二核期极显著的降低。因此,推测AOX1α基因在生理型不育系单核期和二核期的异常表达,可能影响了花药发育过程中抗氰呼吸途径,导致呼吸代谢紊乱,引起花药败育。 2.实时荧光定量分析AOX1c基因在遗传型雄性不育系、生理型雄性不育系和正常可育系旗叶、单核期、二核期和三核期的表达情况,结果表明,AOX1c基因在可育系、遗传型不育系和生理型不育系各时期的表达规律一致,都表现为先升后降;但在表达量上,可育系与生理型不育系的各时期的表达量两者几乎没有差异,遗传型不育系中的单核期表达量极显著的低于可育和生理型不育。因此,推测AOX1c基因没有参与小麦生理型雄性不育的代谢调节。 3.通过荧光定量结果,可以发现AOX1α基因和AOX1c基因都参与了遗传型雄性不育的代谢调节,但AOX1c基因尚未参与小麦生理型雄性不育的代谢调节,预示生理型雄性不育与遗传型雄性不育的代谢机理可能不同。

关键词：小麦杀雄剂sq-1 AOX1基因荧光定量PCR

顺乌头酸酶基因在杀雄剂sq-1诱导小麦雄性不育花药中的表达分析

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第8期26卷 740-748页

作者：张明珠袁蕾王俊生张改生郭文江张龙雨西北农林科技大学陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室/小麦育种教育部工程研究中心陕西杨凌712100 河南省封丘县第一职业高中河南封丘453300

采用RT-PCR技术,克隆了小麦胞质顺乌头酸酶基因(cACO)部分cDNA序列.该cDNA序列长1368bp,编码456个氨基酸,GenBank登录号为GU475062.半定量RT-PCR结果表明,在生理型不育和可育花药发育的单核早期至三核期,cACO基因的表达水平均表现为先... 详细信息

采用RT-PCR技术,克隆了小麦胞质顺乌头酸酶基因(cACO)部分cDNA序列.该cDNA序列长1368bp,编码456个氨基酸,GenBank登录号为GU475062.半定量RT-PCR结果表明,在生理型不育和可育花药发育的单核早期至三核期,cACO基因的表达水平均表现为先升后降;在生理型不育花药发育的单核晚期cACO基因表达水平与同期可育花药相比显著升高,到二核期和三核期明显降低,ACO酶活性变化表现出相同趋势.这反映出在小麦生理型不育系中,cACO基因在花药败育关键期异常表达可能影响了花药发育过程中正常的能量供应和物质代谢,导致花粉发育能量不足和所需物质匮乏,从而导致了非遗传型花药败育现象.

关键词：小麦杀雄剂sq-1 生理型雄性不育顺乌头酸酶(cACO) 克隆

小麦生理型雄性不育花药绒毡层和孢粉素变化与RAFTIN1表达的关系

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中国农业科学 2011年第19期44卷 3937-3944页

作者：盛英张改生李亚鑫张龙雨王书平赵新亮王亮明宋瑜龙西北农林科技大学农学院/陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室/小麦育种教育部工程研究中心

【目的】研究小麦生理型雄性不育花药绒毡层变化、孢粉素累积与RAFTIN1表达间的关系,为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定基础。【方法】以杀雄剂sq-1诱导的生理型雄性不育系、质核互作遗传型雄性不育系,正常可育近等基因系为试材,通过... 详细信息

【目的】研究小麦生理型雄性不育花药绒毡层变化、孢粉素累积与RAFTIN1表达间的关系,为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定基础。【方法】以杀雄剂sq-1诱导的生理型雄性不育系、质核互作遗传型雄性不育系,正常可育近等基因系为试材,通过石蜡切片、细胞荧光染色和荧光定量PCR技术,研究小孢子不同发育时期花药绒毡层的形态变化、孢粉素的累积及RAFTIN1的表达。【结果】单核期生理型不育系花药绒毡层提前降解,分泌孢粉素的含量降低,RAFTIN1提前高表达,使大量孢粉素转运至花粉壁层;二核期和三核期,生理型不育系绒毡层完全退化,停止分泌孢粉素,RAFTIN1呈现明显的下调表达模式。【结论】杀雄剂sq-1诱导的小麦生理型雄性不育其败育机理与绒毡层的提前降解和定向转运孢粉素的RAFTIN1表达高低直接相关。

关键词：小麦(Triticum aestivum.L.) 杀雄剂sq-1 绒毡层孢粉素 RAFTIN1 实时荧光定量PCR

小麦生理型雄性不育系中反式烯脂酰-CoA还原酶基因(TaECR)的克隆及表达分析

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农业生物技术学报 2013年第7期21卷 792-798页

作者：巴青松张改生车会学刘红占张龙雨王书平西北农林科技大学国家杨凌农业生物技术育种中心/国家小麦改良中心杨凌分中心/小麦育种教育部工程研究中心/陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室

超长链脂肪酸(VLCFAs)代谢在花药发育中发挥着重要的作用,而反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase,ECR)是催化超长链脂肪酸合成的脂肪酰-CoA延长酶之一。为进一步研究杀雄剂sq-1诱导小麦雄性不育的机理,根据已报道二穗... 详细信息

超长链脂肪酸(VLCFAs)代谢在花药发育中发挥着重要的作用,而反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase,ECR)是催化超长链脂肪酸合成的脂肪酰-CoA延长酶之一。为进一步研究杀雄剂sq-1诱导小麦雄性不育的机理,根据已报道二穗短柄草(Brachypodium distachyon)ECR基因,采用电子克隆获得序列并设计引物,从小麦(Triticum aestivum)中克隆ECR的开放阅读框cDNA序列,命名为TaECR,将该序列提交至GenBank,登录号为KC222053。序列分析表明,TaECR基因编码310个氨基酸,具有反式烯脂酰-CoA还原酶的经典结构域。表达分析表明,TaECR基因在小麦花药、颖片、叶和根中均有表达,其中在根中的表达量最底;与可育系相比,TaECR基因在生理型不育系三核期中表达急剧下调,在单核期和二核期表达趋势无显著变化,并与其蜡质积累量变化趋势基本一致,这表明TaECR基因调节的超长链脂肪合成途径可能参与了sq-1诱导的败育过程。

关键词：小麦杀雄剂sq-1 TaECR 超长链脂肪酸雄性不育

小麦染色体组蛋白泛素化与生理型雄性不育相关性的研究

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农业生物技术学报 2013年第4期21卷 396-406页

作者：桑青刘红占张改生朱启迪祝万万张龙雨车会学西北农林科技大学国家杨凌农业生物技术育种中心/国家小麦改良中心杨凌分中心/小麦育种教育部工程研究中心/陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室

小麦(Triticum aestivumL.)杂种优势利用与雄性不育机理的研究,多年来一直是世界性设法攻克的科学难关。为了研究小麦生理型雄性不育与组蛋白泛素化的关系,进而为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定基础。以小麦品种西农1376为供试材料,... 详细信息

小麦(Triticum aestivumL.)杂种优势利用与雄性不育机理的研究,多年来一直是世界性设法攻克的科学难关。为了研究小麦生理型雄性不育与组蛋白泛素化的关系,进而为揭示小麦生理型雄性不育的机理奠定基础。以小麦品种西农1376为供试材料,化学杂交剂sq-1为雄性不育诱导剂,首先创建其可育与不育等生理系,然后提取两者的组蛋白,采用Westernblot的方法研究其泛素化水平;克隆出催化组蛋白H2B泛素化的E2酶基因RAD6的cDNA功能序列,并对其进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR技术分析RAD6基因的表达特性。结果显示,在小花发育的3个时期,组蛋白H3的泛素化修饰水平在可育株与不育株之间无明显差异。在单核期,组蛋白H2A的泛素化修饰仅发生在可育株中,而不育株中没有发生;组蛋白H2B的泛素化水平在不育株中明显低于可育株,同时不育株中RAD6基因的表达明显受到抑制。这些均表明,在小麦生理型雄性不育败育关键期(单核期),不育株小花中RAD6基因的表达显著下降,同时其催化的组蛋白H2B泛素化水平也明显下降,以及组蛋白H2A没有泛素化修饰,可能影响某些关键基因的转录而导致小麦败育。由此可见,小麦组蛋白泛素化水平与生理型雄性不育密切相关,这为小麦生理型雄性不育组蛋白泛素化调控机制提供了科学依据,进而为深入探究小麦生理型雄性不育机理提供了坚实的表观遗传研究基础资料。

关键词：小麦杀雄剂sq-1 免疫印迹组蛋白泛素化 RAD6 荧光定量PCR 生物信息学