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微生物学报 2023年第4期63卷 1447-1459页

作者：何亚文 Azad Sepideh Mazhari 崔莹姚润贤 Law Woan-Fei Jodi Lee Learn-Han 郝祥蕊张红艳上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室、代谢与发育科学国际合作联合实验室、上海交通大学-上海农乐生物农药与生物肥料联合研发中心上海200240 Novel Bacteria and Drug Discovery Research Group(NBDD) Microbiome and Bioresource Research Strength(MBRS)Jeffrey Cheah School of Medicine and Health SciencesMonash University MalaysiaJohor Bahru 47500Malaysia 上海农乐生物制品股份有限公司上海201419

【目的】为保证农业生产可持续性发展,研发和使用环境友好的生物农药受到全社会的高度重视。微生物代谢产物农药是我国目前应用最广的生物农药,也是未来发展绿色农药的一个重要方向。【方法】利用包含水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae *... 详细信息

【目的】为保证农业生产可持续性发展,研发和使用环境友好的生物农药受到全社会的高度重视。微生物代谢产物农药是我国目前应用最广的生物农药,也是未来发展绿色农药的一个重要方向。【方法】利用包含水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)PXO99A的NA培养基琼脂平板,从水稻根际土壤中筛选能抑制Xoo生长的链霉菌。通过高效液相色谱和质谱分析活性代谢产物的化学结构;采用剪叶法接种Xoo到水稻叶片后,再喷施杀粉蝶菌素溶液(0.1 g/L),2周后测定叶枯症状;采用响应面分析法优化高产杀粉蝶菌素的发酵培养基;采用PacBio SMRT测序平台+Illumina HiSeq X Ten平台开展全基因组测序。平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)用于比较HSW2009与其他链霉菌在全基因组水平的亲缘关系。【结果】分离到一株对Xoo生长有强抑制活性的链霉菌HSW2009,其活性代谢产物为杀粉蝶菌素A1(piericidin A1,简称PIE);喷施PIE可以减轻Xoo在水稻叶片内的侵染;优化HSW2009高产PIE的发酵条件,得到MFM培养基;HSW2009在MFM培养中生长快、PIE发酵效价最高可以达到0.72 g/L;菌落表型分析、PIE生物合成基因簇分析、全基因组测序和ANI分析表明HSW2009与目前有效描述的PIE产生菌不同。【结论】HSW2009是一株高产杀粉蝶菌素A1的链霉菌属候选新种,命名为绍武链霉菌,可作为杀粉蝶菌素产业化研究的出发菌株。

关键词：链霉菌代谢产物杀粉蝶菌素水稻白叶枯菌生物防治

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杀粉蝶菌素A1生物合成中调控蛋白PieR的功能研究

杀粉蝶菌素A1生物合成中调控蛋白PieR的功能研究

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作者：李艳上海交通大学

学位级别：硕士

杀粉蝶菌素A1属于α-吡啶酮类抗生素,由于其可竞争性结合线粒体复合体I,因此具有抑制呼吸作用的活性。作为一种线粒体呼吸作用抑制剂,其对致病真菌活性较强并且对蚕和菜青虫具有显著的杀虫效果。在筛选抗肿瘤试剂的过程中发现杀粉蝶菌... 详细信息

杀粉蝶菌素A1属于α-吡啶酮类抗生素,由于其可竞争性结合线粒体复合体I,因此具有抑制呼吸作用的活性。作为一种线粒体呼吸作用抑制剂,其对致病真菌活性较强并且对蚕和菜青虫具有显著的杀虫效果。在筛选抗肿瘤试剂的过程中发现杀粉蝶菌素A1能够抑制内质网上的应激蛋白GRP78,从而降低肿瘤细胞对细胞内毒性和抗肿瘤试剂的抵抗力并且其可以与糖基化杀粉蝶菌素A1协同作用,抑制人类恶性上皮瘤细胞丝状伪足的生长。此外,杀粉蝶菌素A可作为群体感应系统抑制剂,参与到由欧文氏杆菌引起的马铃薯软腐病防治中。因此,这种具有广泛生物活性的杀粉蝶菌素A1的生物合成机制研究无疑具有重要意义。前期研究中,已经成功鉴定了票霉素链霉菌杭州湾变种中杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇并推测出其生物合成途径。然而,生物合成基因簇中调控基因pieR的具体调控机制并不清楚。在本研究中,我们首先对PieR进行生物信息学分析,通过比对发现PieR属于SARP蛋白家族,其结构包含N端负责DNA结合的HTH结构域以及C端的细菌转录激活结构域。并且,通过结构预测发现HTH结构域呈现两端为β-折叠,中间为α-螺旋的结构,而C端由7个α-螺旋组成,这为之后的研究提供了一定的理论指导;然后,对pieR基因进行体内敲除和回补,通过发酵检测、HPLC分析,发现pieR基因的缺失使杀粉蝶菌素A1的产量有了明显的下降,而回补菌株能够成功回补回杀粉蝶菌素A1的产量。同时,过表达的菌株杀粉蝶菌素A1的产量相对于野生型的菌株也有2.3倍的提高。再通过生长测定排除pieR的敲除对菌株生长的影响后,确定pieR基因正调控杀粉蝶菌素A1的产生;另外,我们对杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇的转录单元进行了确定,发现整个基因簇从属于同一转录单元;在确定转录单元之后,通过RT-qPCR技术检测pieR的敲除对基因簇中转录单元转录水平的影响,发现pieR的敲除使基因簇的转录水平有了很大的下降从而影响杀粉蝶菌素A1的产量;最后,体外表达PieR之后,通过EMSA和DNase I footprinting实验确定PieR作用于整个基因簇的上游,推测其通过与两个5 nt(5’-CCGGA-3’)的正向重复结合从而激活整个基因簇的转录。总之,本研究完善了杀粉蝶菌素A1生物合成机制,组合运用生物信息学、体内基因敲除及回补以及体外生化分析,确定了SARP蛋白家族的转录调控基因pieR正调控杀粉蝶菌素A1的生物合成,这些研究为通过转录调控工程优化杀粉蝶菌素A1的产量奠定了基础并且为构建高产菌株提供了切实可行的有效手段。

关键词：杀粉蝶菌素转录调控次级代谢 SARP

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放线菌次级代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物学研究

放线菌次级代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物学研究

引用

作者：周瑜华东理工大学

学位级别：硕士

在菌种的筛选过程中发现一株产生杀虫及除草活性物质的放线菌,命名为612243,本文对着两种活性物质进行系统的研究,并对该放线菌进行了种属归类。将612243的发酵产物进行一系列的粗分离和精制操作,通过生物跟踪实验,溶剂萃取、层析及高... 详细信息

在菌种的筛选过程中发现一株产生杀虫及除草活性物质的放线菌,命名为612243,本文对着两种活性物质进行系统的研究,并对该放线菌进行了种属归类。将612243的发酵产物进行一系列的粗分离和精制操作,通过生物跟踪实验,溶剂萃取、层析及高效液相色谱制备获得具有杀虫活性产物的化合物SSPRC-612243-A和一个具有除草活性的化合物SSPRC-612243-B.经光谱学分析,最后得出SSPRC-612243-A分子量为415,分子式为C25H37NO4。经文献查阅和图谱分析,得出该化合物与杀粉蝶菌素A (piericidin A)相同。另一种化合物SSPRC-612243-B经同样分析手段,分子量为577,分子式为C31H47NO9与文献报道的glucopiericidin A相同。但未有文献报道其除草活性的研究,经进一步的深入研究,以高效液相色谱法建立了SSPRC-612243-A和B的分析方法。为发酵、提取等过程的研究提供理论依据。另外,本文对另一菌种709084产生的代谢物吲哚霉素对叶绿素合成的影响做了相应的研究,测定了在施加吲哚霉素条件下叶绿素合成过程的中间产物含量与正常生长过程相比较,发现加入吲哚霉素后,与对照相比较叶绿素含量大大降低,其前体物尿卟啉原Ⅲ和粪卟啉Ⅲ减少,而δ-氨基酮戊酸和原卟啉Ⅸ量积累较多,从而可以认为吲哚霉素可以多个部位影响叶绿素的合成。

关键词：农药分离纯化杀粉蝶菌素糖基杀粉蝶菌素吲哚霉素

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