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接种密度对C57BL/6小鼠CIK细胞增殖、分化及杀瘤作用的影响

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生物技术通讯 2017年第3期28卷 342-346页

作者：李光宗曾喜欢刘英富霍景瑞郁硕张益侯世科陈小义陈锋武警后勤学院附属医院救援医学研究所天津300162 锦州医科大学辽宁锦州121001 武警后勤学院细胞生物与医学遗传学教研室天津300309

目的:探讨不同接种密度对C57BL/6小鼠细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖分化及杀瘤作用的影响,进一步优化CIK细胞培养方法。方法:按照1×10~6/mL(A组)、4×10~6/mL(B组)、8×10~6/mL(C组)、12×10~6/mL(D组)4种接种密度培养细胞,加... 详细信息

目的:探讨不同接种密度对C57BL/6小鼠细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖分化及杀瘤作用的影响,进一步优化CIK细胞培养方法。方法:按照1×10~6/mL(A组)、4×10~6/mL(B组)、8×10~6/mL(C组)、12×10~6/mL(D组)4种接种密度培养细胞,加入必要的细胞因子,14 d后收获细胞,通过流式细胞术、CCK-8法对细胞增殖、分化、杀瘤作用进行分析。结果:培养过程中,C组细胞形态及增殖能力优于A、B组,在14 d时收获细胞并对其进行检测时发现,C组CD3^+/NK1.1^+细胞所占比例明显高于A、B组,杀瘤活性也优于A、B组;D组细胞密度过大,在7 d细胞进入快速增殖期后出现大面积死亡。结论:适当提高C57BL/6小鼠CIK细胞的接种密度利于细胞增殖、分化及杀瘤作用的形成,选择8×10~6/mL的接种密度是较为合适的。

关键词：细胞因子诱导的杀伤细胞密度细胞培养增殖杀瘤作用

膜TNF-α在小鼠Con A-LAK细胞介导的MHC非限制性杀瘤效应中的作用

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中国肿瘤生物治疗杂志 1998年第4期5卷 265-268页

作者：赵亚莉施广霞郭连英钱振超张晨大连医科大学肿瘤研究所大连116027 中国人民解放军第210医院

本文研究Con A预刺激小鼠LAK细胞(Con A-LAK)的体外杀瘤活性,探讨膜TNF-α在其杀瘤效应中的作用.结果表明.Con A-LAK可杀伤NK敏感的YAC-1、TNF敏感的L929及H-2低/无表达的HCa-F等肿瘤靶细胞;其杀瘤作用主要是直接杀伤,而效应细胞表面配... 详细信息

本文研究Con A预刺激小鼠LAK细胞(Con A-LAK)的体外杀瘤活性,探讨膜TNF-α在其杀瘤效应中的作用.结果表明.Con A-LAK可杀伤NK敏感的YAC-1、TNF敏感的L929及H-2低/无表达的HCa-F等肿瘤靶细胞;其杀瘤作用主要是直接杀伤,而效应细胞表面配体与靶细胞表面受体相互作用介导的非分泌途径起着重要的作用;Con A-LAK表达膜TNF-α,后者参与杀伤TNF敏感的肿瘤靶细胞,可能是介导MHC非限制性、抗原非特异性杀瘤效应的重要效应分子之一.

关键词： LAK细胞 MHC 杀瘤作用肿瘤坏死因子

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的基础与临床研究新进展

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中国免疫学杂志 2011年第1期27卷 88-92页

作者：邢宏韩方正汪莉萍徐州医学院附属医院传染科徐州221002

随着肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重,应对肿瘤的治疗模式也发生着日新月异的变化,各种肿瘤治疗的新药物、新技术、新方法层出不穷,其中细胞生物治疗已经初露锋芒,成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。继淋巴因子激活杀伤细胞（LAK）... 详细信息

随着肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重,应对肿瘤的治疗模式也发生着日新月异的变化,各种肿瘤治疗的新药物、新技术、新方法层出不穷,其中细胞生物治疗已经初露锋芒,成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。继淋巴因子激活杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）及CD3单抗激活的杀伤细胞（CD3AK）后，细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine—induced killer，CIK）的杀瘤作用日益受到重视。

关键词：细胞因子诱导的杀伤细胞临床研究肿瘤生物治疗淋巴因子激活杀伤细胞肿瘤浸润淋巴细胞激活的杀伤细胞 CD3单抗杀瘤作用

IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究

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IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究

作者：李安娜广西医科大学

学位级别：硕士

第一部分人IL-2基因克隆及重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体的构建目的:克隆人白细胞介素2基因(IL-2),构建重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体。方法:从PHA体外刺激培养的Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR... 详细信息

第一部分人IL-2基因克隆及重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体的构建目的:克隆人白细胞介素2基因(IL-2),构建重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体。方法:从PHA体外刺激培养的Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法制备互补DNA(cDNA)模板,以PCR方法扩增IL-2基因,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆经鉴定后测序,将测序正确的IL-2基因片段用BglⅡ和PmeⅠ双酶切消化回收并纯化后定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中。酶切鉴定后通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,并使用TCID50法测定AdBM5-GFP-IL-2重组腺病毒滴度。结果:采用RT-PCR法克隆出IL-2基因,经基因测序显示克隆的IL-2序列完全正确,全长528bp,含462个碱基开放读框。构建出pAdBM5-GFP-IL-2真核表达载体。经HEK293A细胞体外扩增,3天后即见绿色荧光蛋白的表达,11天可见噬斑的出现。纯化后的重组腺病毒AdBM5-GFP-IL-2滴度可达5×10PFU/ml。结论:成功构建了含IL-2基因的重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-IL-2),为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础。第二部分人IL-2转染的CIK细胞联合DC对肝癌细胞的杀伤作用目的:探讨IL-2基因转染的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)联合树突状细胞(DC)对肝癌细胞的杀伤作用。方法:采用密度梯度离心法从健康人外周血中分离单个核细胞(PMBC),分别诱导CIK细胞(培养体系:将分离得到的PMBC置于培养箱培养2小时,收集悬浮细胞,采用抗CD3单克隆抗体50ng/ml、rhIL-21000U/ml、rhIL-1 1000U/ml和IFN-γ1000U/ml联合诱导培养CIK细胞)和DC(培养体系:贴壁细胞经rhIL-4 100ng/ml和rhGM-CSF 100ng/ml诱导培养DC)。用携带IL-2基因的重组腺病毒AdBM5-GFP-IL-2转染CIK细胞(MOI=100),用HepG2肝癌冻融抗原冲击致敏DC(DC与肝癌抗原的比例为1:20),然后将转染IL-2基因的CIK细胞(CIKpIL-2)与肝癌抗原致敏DC(DC-Ag)共培养,制备肝癌抗原致敏DC激活的IL-2基因修饰的CIK细胞(DC-Ag-CIKpIL-2)。采用MTT法检测CIK、DC-CIK、DC-Ag-CIK、DC-CIKpIL-2、DC-Ag-CIKpIL-2对肝癌HepG2细胞的杀伤作用,效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1,同时以肝癌细胞H7404、白血病细胞K562作为靶细胞进行杀伤对照实验。结果:DC-Ag-CIKpIL-2与DC-CIKpIL-2细胞组显示了很强的抗肝癌作用,在效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1时,DC-Ag-CIKpIL-2对HepG2的杀伤活性分别为(37.28%±5.71、50.82%±4.95、62.72%±3.78),DC-CIKpIL-2对HepG2的杀伤活性分别为(35.16%±2.22、42.67%±5.26、59.93%±6.71),均高于CIK(19.14%±3.28、28.14%±2.43、44.23%±5.33)、DC-CIK(47.86%±3.27、32.36%±4.62、22.60%±1.83)、DC-Ag-CIK(51.41%±1.43、35.34%±2.57、22.83%±1.67)对HepG2肝癌细胞的杀伤活性(各组间比较均为P＜0.05);DC-Ag-CIKpIL-2与DC-CIKpIL-2对K562、H7404细胞也显示出较强的杀伤活性。DC-Ag-CIKpIL-2细胞组与DC-CIKpIL-2细胞组的杀瘤活性比较,差异无统计学意义(在效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1时二组间比较P值分别为:0.58、0.12和0.56)。杀瘤作用随着效靶比的增高而增强。结论:经DC激活的IL-2基因转染的CIK细胞具有更强的抗肝癌作用,本实验为CIK细胞治疗肝癌及肝癌的过继免疫治疗提供实验依据,有一定的指导意义。

关键词： IL-2 基因克隆重组腺病毒载体 pAdBM5-GFP CIK DC 肝癌腺病毒杀瘤作用

人肺腺癌GLC-82细胞提取热休克蛋白70抗瘤效应的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2005年第2期25卷 88-88页

作者：刘志勇董驹张树波马立人李新王国臣陈志全郑毛根华北煤炭医学院附属医院心胸外科唐山063000 华北煤炭医学院微生物教研室华北煤炭医学院附属医院内窥镜室唐山063000

为了寻找一种肺腺癌有效的治疗方法,我们探索肺癌GLC-82细胞产生的热休克蛋白70(HSP-70)的杀瘤作用.HSP-70的制备如下:常规培养的人肺腺癌GLC-82细胞经43℃ 30 min处理后,置常规培养条件下培育12 h,以EDTA-胰蛋白酶复合消化液分散细胞,... 详细信息

为了寻找一种肺腺癌有效的治疗方法,我们探索肺癌GLC-82细胞产生的热休克蛋白70(HSP-70)的杀瘤作用.HSP-70的制备如下:常规培养的人肺腺癌GLC-82细胞经43℃ 30 min处理后,置常规培养条件下培育12 h,以EDTA-胰蛋白酶复合消化液分散细胞,调整细胞浓度为106/ml,加入10倍体积的细胞裂解液混匀,置4℃ 12～20 h,细胞裂解成絮状,经透析浓缩后以低温高速离心,DEAE-52离子交换色谱和SephdexG-200分子筛过滤及饱和硫酸盐析等方法分离,提纯HSP-70.经过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及酶联免疫吸附法(ELISA)进行定量定性检测。

关键词：人肺腺癌热休克蛋白70 抗瘤效应细胞提取 GLC-82细胞 HSP-70 细胞裂解液治疗方法杀瘤作用培养条件胰蛋白酶 EDTA 细胞浓度高速离心消化液