检索结果-南通市图书馆

作者：李佩山东大学

学位级别：硕士

对蛋白质分子的灵敏特异性检测在分子诊断学和生物医药研究方面具有重要意义。为了实现蛋白质的识别和检测,具有特异性结合能力的亲和配体成为了重要元件。在蛋白质的亲和配体中,小分子连接的DNA分子由于具有免固定、免分离且易于与基... 详细信息

对蛋白质分子的灵敏特异性检测在分子诊断学和生物医药研究方面具有重要意义。为了实现蛋白质的识别和检测,具有特异性结合能力的亲和配体成为了重要元件。在蛋白质的亲和配体中,小分子连接的DNA分子由于具有免固定、免分离且易于与基于核苷酸的信号放大方法结合的特点受到了越来越多的关注。末端保护是指利用小分子连接的DNA实现对蛋白质的识别,并通过外切酶的降解实现将这种特异性的识别事件转化为特异DNA链的出现。这种识别和信号转导方式均相,简单,对DNA序列编码无限制,为蛋白质分子的特异性检测提供了有力平台。为了提高蛋白质检测方法的灵敏度,通过信号放大方法使一个蛋白质分子的出现对应多个信号输出事件是十分必要的。随着科技的发展,越来越多的信号放大方法被建立起来。其中基于核酸酶的等温信号放大方法具有等温、简便笋优势,因此受到越来越多的关注。其中,基于聚合酶和外切酶III的信号放大方法具有快速、高效和通用的优势,在发展高灵敏检测方法方面具有很大的应用潜力。我们通过巧妙设计,利用级联和指数化的策略对基于聚合酶和外切酶III的信号放大方法进行进一步的改进,以提高其信号放大效率,并通过与基于末端保护的识别机制相结合,建立灵敏、特异的蛋白质检测方法。本论文共分为三章：第一章为绪论,内容分为末端保护和基于核酸酶的等温信号放大技术两部分。末端保护部分介绍了其背景,原理,及优势,从基于小分子连接的DNA、适体构象转变和序列特异双链三个不同的探针类别分别追溯了其起源、发展现状和发展趋势,并对每种类别的不足之处及其对目标物测定可能造成的影响进行了分析。此外还介绍了基于末端保护的常用的目标物识别策略,对典型的报道进行了总结。第二部分根据依赖的核酸酶种类的不同,介绍了常用的基于核酸酶的等温信号放大技术,对其中典型的信号放大方法的起源和发展过程进行了追溯。在第二章中,设计了一种基于循环链取代聚合反应的DNA分子机器,用来实现对特异性核苷酸序列的双重放大,并成功与末端保护结合,用于蛋白质分子的灵敏检测。通过这种协同的DNA分子机器调控的双重放大过程,本方法能够实现在线性范围0.80 pM到1.0 nM之间检测到叶酸受体,并且检测限达0.23 pM,此灵敏度与目前大多数叶酸受体检测方面的灵敏度相当。此外,这种检测方法通过产生G四倍体序列插入N-甲基卟啉二丙酸IX进行信号输出,因此无需荧光标记。在第三章中,利用基于外切酶Ⅲ的指数型信号放大方法结合末端保护策略建立了一种灵敏检测蛋白质的方法。此方法中茎部封闭了一端引物序列的发卡被用于进行指数放大。氧化石墨烯,能够区分降解前后的发卡并造成荧光差异,被用于进行信号输出。利用荧光方法证明了信号输出和整体方案的可行性。目标物的出现造成信号的明显提高,证明这种检测方法在实现灵敏、特异的检测蛋白质方面具有很高潜力。

关键词：末端保护等温信号放大蛋白质检测叶酸受体荧光技术

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关于末端保护装置移至室外运行的探讨

农村电气化 2004年第12期 9-10页

作者：张勇杨继绰周晓燕山东省莘县电业公司 252400

基于DNA酶和小分子连接DNA末端保护的蛋白质荧光分析

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基于DNA酶和小分子连接DNA末端保护的蛋白质荧光分析

作者：周曼河北大学

学位级别：硕士

蛋白质是生命体的基本组成成分,是维持生命正常生理功能的重要活性物质。蛋白质与营养代谢、物质运输、机能防御、遗传等生理活动密切相关。而且有研究表明,在疾病的发展过程中,一些特异性蛋白质的表达与分布也会发生改变,因此蛋白质的... 详细信息

蛋白质是生命体的基本组成成分,是维持生命正常生理功能的重要活性物质。蛋白质与营养代谢、物质运输、机能防御、遗传等生理活动密切相关。而且有研究表明,在疾病的发展过程中,一些特异性蛋白质的表达与分布也会发生改变,因此蛋白质的分析检测对掌握蛋白质的生理功能,研究蛋白质参与的生理活动以及相关疾病的诊断、治疗都具有重要意义。基于小分子配体和蛋白质之间的特异性相互作用的末端保护原理最近引起了蛋白质研究工作者的广泛兴趣。末端保护是指首先将小分子配体连接在DNA上,目标蛋白质与小分子配体结合后,能够阻止外切酶对连接小分子的DNA链进行消解。末端保护对DNA序列的编码无限制,可以与各种基于核酸的扩增技术和检测手段相结合,这为蛋白质分子的灵敏检测提供了新的途径。本论文基于小分子连接DNA末端保护原理建立了系列蛋白质荧光分析的方法,主要内容如下:方法一:基于DNA酶和小分子连接DNA末端保护的荧光信号降低法检测蛋白质。在本实验中,我们设计了一个发夹结构的DNA探针。探针3’端标记有生物素(biotin)。当目标蛋白质-链霉亲合素(STV)不存在时,核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)能够特异性地从3’端水解DNA探针的双链部分。未被水解的探针的单链部分能够形成DNA酶(DNAzyme)结构。DNAzyme与加入的分子信标结合,在中间的RNA碱基处将分子信标切断。分子信标上的荧光基团和猝灭基团因此而分离,荧光信号恢复。之后,DNAzyme又与新的分子信标结合,发生剪切作用,释放荧光基团。DNAzyme不断循环利用,直至全部的分子信标参与反应,荧光信号达到最强。加入目标蛋白质STV后,STV与biotin特异性结合,能够阻止ExoⅢ从3’端水解DNA探针的双链部分。DNA探针仍然保持发夹结构,无法形成DNAzyme。没有DNAzyme的作用,分子信标不能被切断,保持荧光猝灭状态。该方法通过荧光信号的降低对目标蛋白质进行定量测定,可以检测到低至50 pmol的STV。方法简单快速,检测成本低,但灵敏度还有待于进一步提高。方法二:基于DNA酶和小分子连接DNA末端保护的荧光信号放大法检测蛋白质。在本实验中,我们将与小分子连接的DNA探针设计成DNAzyme的序列。目标蛋白质与小分子结合后,末端受到蛋白质保护,核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)不能消解DNA探针。DNA探针保持DNAzyme结构,与加入的分子信标结合,切断分子信标,释放荧光信号。DNAzyme不断循环利用,与新的分子信标结合,发生剪切反应,释放出越来越多的荧光基团,产生越来越强的荧光信号。当没有目标蛋白质出现时,DNA探针被ExoⅠ水解,DNAzyme结构消失,加入的分子信标保持淬灭状态,体系荧光信号很弱。通过检测荧光信号的增长来实现目标蛋白质的定量检测。我们将该方法分别应用于链霉亲和素(STV)和叶酸受体(FR)的检测,取得了良好的效果。该方法可以检测到低至0.1 pmol的STV和100 ng的FR,灵敏度比方法一提高了500倍。

关键词：蛋白质检测小分子配体末端保护 DNAzyme 分子信标荧光分析

基于小分子连接DNA末端保护结合恒温扩增灵敏检测蛋白质

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基于小分子连接DNA末端保护结合恒温扩增灵敏检测蛋白质

作者：霍利伟河北大学

学位级别：硕士

蛋白质是人体一切细胞和组织的重要组成成分,是生命的物质基础。蛋白质与人体中各种生命活动密切相关,例如:人体中物质的运输、能量的传递、代谢反应的进行、抵御外物的入侵、基因的遗传等等。而且,由于蛋白质种类繁多,功能各不相同,作... 详细信息

蛋白质是人体一切细胞和组织的重要组成成分,是生命的物质基础。蛋白质与人体中各种生命活动密切相关,例如:人体中物质的运输、能量的传递、代谢反应的进行、抵御外物的入侵、基因的遗传等等。而且,由于蛋白质种类繁多,功能各不相同,作用方式多样化,这就给蛋白质的检测提出了挑战。因此丰富蛋白质检测方法,实现对蛋白质的灵敏检测,对蛋白质生理机能的研究以及蛋白质相关疾病的早期诊断、治疗及相应的药物研发具有重要意义。许多蛋白质生理功能的作用离不开小分子的参与,比如链霉亲和素与生物素小分子作用,叶酸受体与叶酸小分子作用。末端保护就是基于目标蛋白质与其小分子特异性作用产生的。目标蛋白质与小分子特异性作用,能够阻止外切酶对小分子连接的DNA的降解。末端保护机制为蛋白质的检测提供了新的思路。本学位论文中,以链霉亲和素-生物素(streptavidin-biotin)作为蛋白质-小分子作用对,基于小分子连接DNA末端保护结合支化滚环扩增(branshed rolling circle amplification,BRCA)和催化发夹组装(catalyzed hairpin assembly,CHA)扩增分别建立了两种新的蛋白质荧光分析方法。(1)基于小分子连接DNA末端保护结合支化滚环扩增反应灵敏检测链霉亲和素。在这个实验中,我们以链霉亲和素(SA)为目标蛋白质。当目标蛋白质-链霉亲和素(streptavidin,SA)存在时,SA与连接在DNA探针3’端的生物素(biotin)小分子特异性结合,形成末端保护,阻止了核酸外切酶I(Exo I)对DNA探针的降解。被保护的DNA探针作为连接探针与挂锁探针的两端杂交。在DNA连接酶的作用下,以连接探针为模板,挂锁探针形成一个闭合的环。然后,以闭合的挂锁探针为模板,加入引物1和反向引物2,在DNA聚合酶的作用下进行延伸,形成支化滚环扩增。由于扩增模板的特殊环状结构,使得最终的延伸产物是含有许多重复序列的DNA双链结构。最后,利用对双链DNA特异性作用的荧光染料SYBR Green I(SG)进行荧光检测。滚环扩增效率可达到10～10倍,可以有效的提高蛋白质检测的灵敏度。该方法灵敏度高,检出限可达到43 fmol。(2)基于小分子连接DNA末端保护结合催化发夹组装无酶扩增检测链霉亲和素。我们设计了一个发夹结构的DNA-AgNCs作为荧光探针。SA与连接在DNA探针的小分子biotin结合形成末端保护。DNA-AgNCs与被保护的DNA探针结合,其发夹结构被打开,继而与另外一个富G序列发夹探针结合,拉近了暗DNA-AgNCs与富G序列之间的距离,激发暗的DNA-AgNCs发射强的荧光。同时,被SA保护的DNA探针被顶替下来与新的DNA-AgNCs结合,激发新一轮反应进行,形成催化发夹组装(CHA)扩增。目标蛋白质越多,荧光强度越大。该方法简单快速,扩增过程无酶参与,节约了检测成本;采用新型纳米材料DNA-AgNCs作为荧光探针,为蛋白质的检测开辟了新的思路。

关键词：蛋白质检测小分子配体末端保护催化发夹组装(CHA) 支化滚环扩增(BRCA) 银纳米簇(AgNCs)

基于小分子连接DNA末端保护结合金纳米粒子的蛋白质分析检测

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基于小分子连接DNA末端保护结合金纳米粒子的蛋白质分析检测

作者：佟银侠河北大学

学位级别：硕士

蛋白质是生命的物质基础,是人体重要组成部分。人体众多的生命活动都有蛋白质参与,如遗传、新陈代谢、能量的运输和免疫反应等,是一类非常重要的生物标志物。研究发现,某些特殊蛋白质的异常表达与肿瘤和癌症的发生和发展密切相关,这些... 详细信息

蛋白质是生命的物质基础,是人体重要组成部分。人体众多的生命活动都有蛋白质参与,如遗传、新陈代谢、能量的运输和免疫反应等,是一类非常重要的生物标志物。研究发现,某些特殊蛋白质的异常表达与肿瘤和癌症的发生和发展密切相关,这些特异性蛋白质表达量的变化可以作为疾病诊断的依据和治疗的靶点。人体内蛋白质种类繁多,功能和作用机制也不尽相同,所以丰富蛋白质检测方法,拓展蛋白质检测思路,对蛋白质作用功能的研究,以及相关疾病的早期诊断和疾病药物的研发具有非常重要意义。小分子连接DNA末端保护是基于DNA链上标记的小分子与蛋白质特异性结合。它能够有效阻止外切酶对DNA链的降解作用。末端保护为蛋白质的检测提供了新的思路。本论文基于小分子连接DNA末端保护结合金纳米粒子,构建了两种检测蛋白质的新方法,主要内容如下:(1)基于末端保护结合金纳米粒子荧光探针检测链霉亲和素。首先我们设计了一个3’端标有-SH,5’端标有荧光基团-Cy5的发夹探针HP。通过-SH与Au的作用,HP标记到金纳米粒子表面,形成金纳米粒子荧光探针,拉近了Cy5与金纳米粒子的距离,发生能量共振转移,Cy5的荧光被金纳米粒子吸收,荧光猝灭。另外设计了一条3’端标记有小分子生物素(biotin)的单链DNA探针,它能够与HP探针杂交结合,将HP探针的发夹结构打开。当目标物链霉亲和素(SA)不存在时,biotin-DNA探针被核酸外切酶Ι(ExoΙ)降解。金纳米粒子荧光探针保持弱荧光;当SA存在时,SA与生物素小分子特异性连接,保护biotin-DNA探针不被ExoΙ降解。SA-biotin-DNA与加入的金纳米粒子荧光探针杂交结合,打开HP的发夹结构,使Cy5远离Au NPs,产生较强的荧光信号。荧光信号增强的程度与目标蛋白SA的量具有一定的定量关系。该方法对SA的检出限为0.65 pmol。该方法简单、选择性好,但是需要荧光标记,增加了检测成本。(2)基于末端保护结合金纳米粒子利用比色、吸光度和光热三种方法检测链霉亲和素。首先设计了一条3’末端标有生物素小分子的单链DNA探针(biotin-DNA)。当目标蛋白质SA存在时,SA与biotin特异性结合,形成SA-biotin-DNA,阻止了ExoⅠ对biotin-DNA的降解。SA-biotin-DNA与加入的发夹探针HP结合,引发外切酶Ⅲ诱导的扩增反应,产生大量的单链DNA。产生的单链DNA吸附在Au NPs表面,阻止了Au NPs因Na Cl导致的盐聚集,溶液颜色为红色,在520 nm具有强的吸收。分散的Au NPs产生光热效应较弱,测量得到的温度较低;当SA不存在时,溶液中biotin-DNA探针被Exo I降解。加入的HP探针不能被打开,不能发生后续的ExoⅢ诱导的扩增反应。金纳米粒子对发夹探针的吸附能力远远不如对单链DNA的吸附能力强。所以,空白溶液中,加入的HP探针不能保护金纳米粒子。在盐的作用下,金纳米粒子发生聚集,溶液变为蓝色,在685 nm具有较强的吸收。聚集状态的金纳米粒子能够产生较强的光热效应,能够检测到显著的温度上升。在这个方法中,能够利用三种信号手段(比色,吸光度和温度)对蛋白质进行检测。

关键词：蛋白质检测末端保护金纳米粒子荧光检测比色检测光热效应

基于DNA末端保护和氧化石墨烯的生长素荧光生物传感器的研制

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基于DNA末端保护和氧化石墨烯的生长素荧光生物传感器的研制

作者：张顺超湖南农业大学

学位级别：硕士

生长素除了包括吲哚-3-乙酸(IAA)等植物内源激素,还包括2,4-D等人工合成生长素。其中IAA是植物自身合成的一种微量有机物质,调节植物的整个生长发育过程。2,4-D则是人工合成生长素类物质,多应用于农业作为除草剂使用。传统的生长素检测... 详细信息

生长素除了包括吲哚-3-乙酸(IAA)等植物内源激素,还包括2,4-D等人工合成生长素。其中IAA是植物自身合成的一种微量有机物质,调节植物的整个生长发育过程。2,4-D则是人工合成生长素类物质,多应用于农业作为除草剂使用。传统的生长素检测方法与技术均存在一定的不足,很难实现对其快速、精准的检测,近年来相继出现的生长素测定新方法大大的提高了生长素测定的精度,但还是不能够满足目前对其检测的需求。为了探索出更有效的生长素检测新方法,本文尝试了基于DNA末端保护的IAA荧光生物传感器和基于氧化石墨烯(GO)修饰的2,4-D免疫竞争荧光生物传感器的研制,获得结果如下： (1)构建了基于DNA末端保护的荧光生物传感器检测IAA的新方法。该方法应用了一条修饰了IAA的杂交链,当加入含有IAA的样品反应一段时间后,样品中的游离IAA可以跟反应液中的IAA抗体蛋白相结合,以阻碍后续反应中抗体和衍生的IAA的结合,继而限制性内切酶Fok I会产生剪切活性通过对荧光探针的反复剪切放大荧光信号响应,从而得到IAA浓度和荧光信号之间的关系。 (2)探明了DNA末端保护的荧光生物传感器的检测IAA的多项重要条件。进行了IAA耦合DNA的试验操作,并利用透析和液相色谱对衍生的IAA进行了分析和纯化,优化了体系所需要的鼠抗IAA抗体浓度为50μtg/mL (3)利用DNA末端保护的荧光生物传感器对IAA进行了定量测量。试验对该荧光传感器在IAA浓度0.1ng/mL-20ng/mL的范围进行了检测。检测IAA的最低浓度为0.1ng/mL。比常用的酶联免疫法最低检测限低了2个数量级,特异性试验证明了该荧光生物传感器的专一性好。 (4)创建了基于氧化石墨烯的荧光生物传感器检测2,4-D的新方法。该方法采用2,4-D对氧化石墨烯进行修饰,衍生的2,4-D耦合氧化石墨烯会由于荧光共振能量转移而猝灭标记在抗体上的荧光基团,当均相溶液中存在目标物2,4-D时,2,4-D会结合标记了荧光基团的抗体蛋白使荧光抗体蛋白远离氧化石墨烯表面,从而检测出荧光信号,建立2,4-D浓度和荧光信号之间的关系。 (5)摸索了基于氧化石墨烯的荧光生物传感器检测2,4-D的基本条件。优化了荧光标记抗体的的最佳浓度为05μg/mL,衍生的氧化石墨烯的最佳浓度为0.6mg/mL。 (6)利用基于氧化石墨烯的荧光生物传感器对2,4-D进行了测量。试验对2,4-D浓度1ng/mL-100ng/mL范围进行检测,获得了2,4-D浓度与荧光强度关系的标准曲线,本试验研制的荧光生物传感器检测的2,4-D最低浓度为1ng/mL,符合国家标准的检测限。

关键词：生长素荧光生物传感器末端保护氧化石墨烯

基于恒温扩增反应检测端粒酶和利用末端保护比色检测蛋白质的研究

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基于恒温扩增反应检测端粒酶和利用末端保护比色检测蛋白质的研究

作者：赵建伟河北大学

学位级别：硕士

端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶,能够阻止端粒DNA的缩短。端粒酶在正常细胞中的活性非常低,很难被检测到,而在癌细胞中活性被激活,活性较高。端粒酶已经被认为是细胞癌变的一种潜在的生物标志物。因此实现对端粒酶的简单、快速、高灵... 详细信息

端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶,能够阻止端粒DNA的缩短。端粒酶在正常细胞中的活性非常低,很难被检测到,而在癌细胞中活性被激活,活性较高。端粒酶已经被认为是细胞癌变的一种潜在的生物标志物。因此实现对端粒酶的简单、快速、高灵敏度检测,对癌症的早期诊断以及研发靶向端粒酶的抗癌药物有着重大意义。蛋白质是生命的物质基础,人体的生命活动都离不开蛋白质的参与,如新陈代谢、免疫反应以及物质能量传输等。有研究表明,蛋白质的异常表达与某些疾病的发生有着密切联系。因此实现对蛋白质的简单、快速、高灵敏度检测,在临床诊断和相应的药物研发中具有重要意义。本学位论文基于恒温指数扩增技术和小分子连接DNA末端保护分别建立了简单、灵敏的端粒酶和链霉亲和素检测的新方法。(1)基于恒温指数扩增反应和磁分离技术检测端粒酶活性即使是在癌细胞中,被激活的端粒酶活性也较低,需要高灵敏度的分析方法才能检测到。恒温指数扩增技术能够在恒温条件,短时间内,对短链DNA进行快速高效的扩增。其在十几分钟内的扩增效率可以与PCR几个小时的扩增效率相媲美。我们利用链顶替作用形成的线性扩增,结合恒温指数扩增技术,设计了一种高灵敏度的端粒酶活性检测方法。同时,我们利用磁性微球捕捉有效的信号产物。通过磁分离,在每一步反应后将过量的反应物有效的进行分离,避免了其对后续反应的影响。最后利用双链特异性的染料SYBR Green I(SG I)对指数扩增结果进行实时定量检测。该方法最低可以检测到20个癌细胞中的端粒酶活性。(2)基于小分子连接DNA末端保护,利用未标记的金纳米粒子比色检测链霉亲和素。基于小分子连接DNA末端保护和未标记的金纳米粒子,我们建立了一个简单新颖的比色检测蛋白质的方法。我们设计了一个3′末端标记biotin的发卡型DNA探针(biton-DNA probe)。基于生物素(biotin)和链霉亲和素(SA)的特异性作用,在靶标蛋白SA存在下,SA与biton-DNA probe的3′末端的biotin特异性结合,能够阻止核酸外切酶III(Exonuclease III,Exo III)对biton-DNA probe的降解,形成末端保护。当靶标蛋白SA不存在时,biton-DNA probe被Exo III降解,生成单链DNA。加入金纳米粒子(AuNPs),单链DNA能够更好地吸附在AuNPs表面,保护AuNPs不被盐离子诱导聚集,溶液颜色为红色;而AuNPs对biton-DNA probe的吸附较弱,不能阻止盐离子诱导AuNPs发生聚集,溶液呈现蓝色。该方法对SA的检出限为0.24 pmol。方法简单灵敏,选择性好,无需标记,没有酶扩增反应参与,检测成本低。

关键词：端粒酶链霉亲和素恒温指数扩增末端保护金纳米粒子比色法

基于末端保护和纳米材料的生物传感新方法的研究

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基于末端保护和纳米材料的生物传感新方法的研究

作者：刘晓萌湖南大学

学位级别：硕士

生命体中蛋白质、核酸、酶活性以及生物小分子活动信息的研究对生物医学以及临床诊断和治疗有着非常巨大的意义。如何实时、动态、快速、准确地获取这些生命活动的信息,就成为了分析化学科研工作者面临的重大的挑战。为了克服这个难题,... 详细信息

生命体中蛋白质、核酸、酶活性以及生物小分子活动信息的研究对生物医学以及临床诊断和治疗有着非常巨大的意义。如何实时、动态、快速、准确地获取这些生命活动的信息,就成为了分析化学科研工作者面临的重大的挑战。为了克服这个难题,就需要我们发展一些准确性高、灵敏度高以及特异性高的定性或定量的方法,达到获取信息的目的。本论文瞄准上述挑战进行研究,基于末端保护技术和纳米材料发展了一系列分别以小分子、核酸、蛋白质和酶活性为检测对象的高灵敏性高选择性的生物传感技术,并通过对实际样品的分析,初步验证了这些技术的可行性和准确性。第2章中,在细胞表面表达的肿瘤特异性蛋白标记物对于癌症早期检测、诊断和治疗是很有价值的目标物。我们基于吸附到DNA3’端的小分子配体和细胞表面表达的蛋白生物标志物之间的相互作用将寡核苷酸标记到细胞表面,然后EXO I能够将非特异性DNA降解,保持无响应,从而确保高特异性检测。这样,一种直接检测核酸的方法就可以替代对于活细胞表面蛋白生物标记物的复杂的、不灵敏的检测方法。由于DNA的信号转换和放大的多种途径,我们基于血红素DNA酶、DNA模板化的AgNCs以及荧光定量PCR,设计了三种信号输出方法分别用于检测、成像以及定量。最终,小分子连接的可编码DNA将会开启一种使用免洗的无标记方法来检测细胞膜蛋白的局面。创立了一种用于细胞膜蛋白质活体检测的简单但有意义的平台。与此同时,将对目标生物标志物的识别转化为对DNA序列的编码,并且还提供了一种同时检测细胞膜表面的多种生物标志物的方法。比如,可以利用设计不同DNA模板来指导合成AgNCs用于多种蛋白质的直接检测与成像。第3章中,多聚核苷酸激酶磷酸酶(PNKP)对DNA的去磷酸化修饰过程在许多的生理活动中起着非常重要的作用。本章以T4多聚核苷酸激酶磷酸酶(T4PNKP)为模型,利用荧光团标记的DNA探针作为T4PNKP的基质,此探针是自组装的单链DNA分子。3’端修饰了磷酸基团作为目标磷酸酶的基质,一旦加入T4PNKP,T4PNKP会将探针的3’磷酸集团水解为羟基,所产生的3’-OH在DNA聚合酶以及dNTPs的作用下迅速扩展,之前的单链DNA变为双链DNA。由于双链DNA和WS2纳米片之间的结合力很弱,延伸后的双链产物在WS2纳米片同时同时存在时有很强的荧光发射,而我们检测到没有聚合酶延伸的探针具有较弱的荧光信号,并且随着WS2纳米片对单链DNA的吸附,荧光猝灭。WS2的超强荧光淬灭能力也为该方法提供了有较宽的线性范围和低的检测限,其检测下限为0.05U/mL。另外,该方法不仅可以对T4PNKP的抑制剂进行定量表征,还适用于复杂生物环境中目标物的测定。本方法设计简单、操作方便、灵敏度高且选择性好,有望成为PNKP酶检测的一种很好的选择并能应用于DNA损伤修复机理的研究。第4章中,SNP对于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究是非常重要的。氧化石墨烯对于单链的DNA分子具有较强的吸附功能,对于荧光基团具有广泛的猝灭功能,对于单个碱基的荧光不会猝灭。我们基于T7核酸外切酶、单个荧光基团标记的核酸探针和氧化石墨烯构建一种简便有效的高灵敏检测技术用于SNP分析。该方法操作简单,响应快速,并且有较高的灵敏度,其检测下限为10pM。

关键词：荧光生物传感技术末端保护银纳米簇二维纳米材料酶活性

基于小分子连接DNA末端保护结合银纳米簇和金纳米粒子的蛋白质分析

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基于小分子连接DNA末端保护结合银纳米簇和金纳米粒子的蛋白质分析

作者：郜捷河北大学

学位级别：硕士

蛋白质是人体细胞、组织、器官的重要组成成分,是一切生命的物质基础。蛋白质与人体的各种生理活动,如维持肌体正常的新陈代谢、保障各类物质在体内的正常输送、保证各种免疫活动的正常进行等,有着密切的关系。研究表明,人类的某些疾病... 详细信息

蛋白质是人体细胞、组织、器官的重要组成成分,是一切生命的物质基础。蛋白质与人体的各种生理活动,如维持肌体正常的新陈代谢、保障各类物质在体内的正常输送、保证各种免疫活动的正常进行等,有着密切的关系。研究表明,人类的某些疾病的发生与蛋白质的异常表达也密切相关。因此开发灵敏、简单、快速的蛋白质检测方法对蛋白质性质、功能的深入研究以及相关疾病的临床诊断,药物研究等都具有非常重要的意义。小分子连接DNA末端保护是利用DNA链上标记的小分子与蛋白质特异性结合,能够有效阻止外切酶对DNA链的降解的作用。在末端保护中DNA序列无编码限制,DNA末端易于标记,而且不影响DNA序列和标记分子的活性,易与DNA扩增手段结合,这些优势为蛋白质的检测提供了新的思路。因此,近年来基于小分子连接DNA末端的保护原理检测蛋白质的方法受到人们的广泛关注。本论文基于小分子连接DNA末端的保护原理分别结合两种金属纳米材料-银纳米簇和金纳米粒子,构建了两种检测蛋白质的新方法,主要内容如下:一、基于小分子连接DNA末端保护结合银纳米簇(AgNCs)荧光检测蛋白质。首先设计了一条3’端标记小分子生物素(biotin)的单链DNA探针,当没有靶蛋白-链霉亲和素(STV)时,biotin标记的DNA探针被Exo I从3’端降解。加入具有强荧光的AgNCs,AgNCs本身的荧光不会受到影响;当STV存在时,STV与biotin特异性结合,保护DNA探针不被Exo I降解。DNA探针与加入的AgNCs 3’端裸露出的序列杂交,能够猝灭AgNCs的荧光。荧光信号降低的程度与靶蛋白质STV的量具有一定的定量关系。实验结果表明,在20 pmol范围内,荧光信号与STV的量具有良好的线性关系,检出限为1.82 pmol STV。该方法简单、成本低廉,特异性良好,但方法灵敏度有待于进一步改善。二、基于小分子连接DNA末端保护结合金纳米粒子(AuNPs)可视化检测蛋白质。我们设计了一条3’端标记biotin的单链DNA探针,当目标蛋白STV不存在时,加入Exo I后DNA探针被降解,AuNPs没有单链DNA探针保护,在一定的盐离子浓度下发生聚集,溶液呈蓝色;当靶蛋白STV存在时,STV与DNA探针上的biotin特异性结合,从而保护DNA探针不会被Exo I降解。带负电的DNA单链探针通过静电结合吸附在AuNPs的表面,阻止了盐离子引起的AuNPs的聚集。分散的AuNPs溶液呈红色。通过AuNPs溶液聚沉前后溶液颜色以及吸光度的变化对目标蛋白质进行定量分析。吸光度比值A/A与STV的量在20 pmol的范围内呈良好的线性关系,STV的检出限为1.40 pmol。该方法不需要贵重的仪器设备,利用裸眼观察即可得到检测结果,更加便捷。

关键词：蛋白质检测末端保护银纳米簇金纳米粒子荧光分析比色检测

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基于末端保护分析的生物传感器研究

基于末端保护分析的生物传感器研究

作者：郭敏湖南大学

学位级别：硕士

生物标志物是一种通常用于指示生物状态的生化指标。通过测量或评估生物标志物可指示生物体所处的正常生理状态，发病进程，药物反应，干预治疗等各个阶段。人体内存在多种生物标志物，其中三类重要的分子水平上的生物标志物包括特定的... 详细信息

生物标志物是一种通常用于指示生物状态的生化指标。通过测量或评估生物标志物可指示生物体所处的正常生理状态，发病进程，药物反应，干预治疗等各个阶段。人体内存在多种生物标志物，其中三类重要的分子水平上的生物标志物包括特定的小分子、蛋白质和突变的基因。不断开发检测小分子和蛋白质、突变基因的生物传感器具有重大的意义。另外，生命体内许多重要的生物过程是由有机小分子和生物活性大分子(蛋白质、核酸等)的识别和相互作用介导并完成的。它们之间的相互作用是构成信号传导、能量传递、物质代谢和功能调控的基础。从化学的角度出发，研究小分子和生物大分子之间的相互作用，特别是小分子与蛋白之间相互作用对于开发化学药物和筛选探针具有重要的研究价值。近年来，已发展了很多研究有机小分子和蛋白质相互作用的分析方法，如荧光共振能量转移法、表面等离子共振法和荧光偏振法等，但是这些方法存在易受干扰、灵敏度不高、适用性不强等缺点，所以迫切需要发展一种高灵敏和高选择性的技术方法。另外，随着人类基因组测序工作的完成,利用生物学检测方法测定个体基因型的基因分型技术也成为研究者们广泛关注的焦点。当前大多数单核苷酸多态分型方法对大量DNA样品的SNP研究均很昂贵。鉴于之上所述，本文开创了一种新型的分析技术，利用小分子标记的末端保护分析来研究有机小分子和结合蛋白的相互作用和SNP基因分型分析。具体内容如下：（1）第二章中阐述小分子标记DNA的末端保护分析的基本原理。末端修饰了小分子的单链DNA与小分子受体蛋白结合后可以阻碍核酸外切酶I的降解。此发现将小分子与蛋白相互作用分析转化为特定DNA序列分析，这样就可以利用各种各样的DNA序列扩增和检测技术来探测有机小分子和受体蛋白的相互作用。基于未被结合蛋白保护的小分子修饰的单链DNA的在单壁碳纳米管表面选择性自组装，我们发展了一种新型的电化学末端保护。通过调控单壁碳纳米管在16-巯基十六酸自组装金电极上的吸附作用而获得不同的氧化还原信号，该方法可以保证实质上的信号扩增放大和低背景电流。我们利用此方法进行了叶酸和叶酸受体FR（一种肿瘤标志物）相互作用分析并进行了定量检测，检测下限FR浓度为3pM，结果证明了电化学末端保护具有理想的特异性和灵敏度。（2）第三章中进一步报道普遍的末端保护现象，小分子标记的DNA与小分子蛋白受体结合后能阻碍各种核酸外切酶的降解。该通用技术将小分子和蛋白质相互作用转化为不同结构的DNA分析，为检测小分子提供了一个有用的技术。在此基础上，本章发展了基于荧光染色的小分子和蛋白质相互作用的均相分析方法，另外，本章中设计了一种基于小分子标记的单链DNA聚合酶延伸的免标记SNP基因型分析技术。利用亲和素-生物素的小分子-蛋白模型体系和39为密码子人β球蛋白基因的SNP模型体系证明了该方法的可行性。结果显示该方法检测小分子和蛋白质相互作用的动态响应范围是从0.5-100nM，检测限为0.1nM。SNP分型技术的动态响应范围是0.1-200nM，检测限为0.02nM。除了理想的灵敏度之外，该项技术还具有高选择性，极好的重现性，低消耗和简单的操作步骤。

关键词：末端保护小分子标记DNA 小分子和结合蛋白相互作用单壁碳纳米管基因分型单核苷酸多态性