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基于Gln/GLS1/α-KG代谢轴和线粒体凋亡信号通路探讨木瓜总三萜抗D-半乳糖诱导GES-1细胞衰老的作用机制

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中国中药杂志 2024年第8期49卷 2230-2246页

作者：贺君宇杨家鑫覃诗颖郑婧琪国怡然马天行三峡大学基础医学院湖北宜昌443002 三峡大学生物与制药学院湖北宜昌443002 南通大学医学院江苏南通226001

木瓜总三萜(total triterpenoids from the fruits of Chaenomeles speciosa,TCS)是防治胃黏膜损伤的活性组分,具有潜在的抗衰老作用。然而,TCS是否改善胃衰老,尤其是对于其抗胃衰老的分子机制目前仍不清楚。基于此,该研究旨在探讨TCS... 详细信息

木瓜总三萜(total triterpenoids from the fruits of Chaenomeles speciosa,TCS)是防治胃黏膜损伤的活性组分,具有潜在的抗衰老作用。然而,TCS是否改善胃衰老,尤其是对于其抗胃衰老的分子机制目前仍不清楚。基于此,该研究旨在探讨TCS对D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1衰老的影响及作用机制,为TCS在临床上用于预防胃衰老提供科学数据。将体外培养的GES-1细胞和转染谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)过表达(overexpression GLS1,GLS1-OE)质粒的GES-1细胞用D-gal诱导衰老后,给予TCS和谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1)抑制剂bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide(BPTES),考察各组细胞存活率、衰老标志物β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,SA-β-gal)染色阳性细胞比例、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞凋亡的变化;采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法和比色法检测各组细胞上清液和细胞内GLS1活性、谷氨酰胺(glutamine,Gln)、谷氨酸(glutamate,Glu)、α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)、尿素和氨水平;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中GLS1、线粒体凋亡信号通路相关基因mRNA和蛋白表达情况。结果显示,与D-gal模型组和GLS1-OE D-gal模型组相比,TCS可显著降低D-gal诱导衰老GES-1细胞和GLS1-OE衰老GES-1细胞SA-β-gal染色阳性细胞率和MMP,抑制衰老细胞存活,促进其细胞凋亡(P<0.01),降低上清液和细胞内GLS1活性和Gln、Glu、α-KG、尿素、氨含量(P<0.01),降低线粒体中细胞色素C(cytochrome C,Cyto C)浓度以及细胞中GLS1、增殖细胞核抗原mRNA和蛋白表达(P<0.01),降低细胞中Bcl-2、Bcl-xl mRNA表达和前体半胱氨酸蛋白酶(pro-caspase)-9、pro-caspase-3蛋白表达以及Bcl-2/Bax和Bcl-xl/Bad比值(P<0.01),升高胞质中Cyto C浓度和细胞中Bax、Bad、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease activating factor 1,Apaf-1)mRNA表达及剪切型半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)-9、cleaved-caspase-3、剪切型聚ADP核糖聚合酶-1(cleaved-poly ADP ribose polymerase-1,cleaved-PARP-1)蛋白表达(P<0.01)。以上结果表明,TCS可对抗D-gal诱导GES-1细胞衰老,其作用机制与抑制Gln/GLS1/α-KG代谢轴、激活线粒体凋亡通路,进而促进衰老细胞凋亡、清除衰老细胞密切相关。

关键词：木瓜总三萜 GES-1细胞 D-半乳糖衰老谷氨酰胺/谷氨酰胺酶1/α-酮戊二酸代谢轴线粒体凋亡通路

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木瓜总三萜和奥美拉唑联用对吲哚美辛诱导大鼠胃溃疡的治疗作用研究

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中国中药杂志 2019年第11期44卷 2338-2347页

作者：贺海波李小琴李小妹何毓敏覃慧林张永峰熊兴军汪鋆植邹坤三峡大学生物与制药学院湖北宜昌443002 三峡大学医学院湖北宜昌443002 长阳县中医医院湖北宜昌443001

观察木瓜总三萜和奥美拉唑联用对吲哚美辛诱导胃溃疡大鼠治疗作用,并探寻其可能作用机制。将大鼠随机分为正常组、模型组、奥美拉唑(3.6 mg·kg-1)组、木瓜总三萜(100 mg·kg-1)组、木瓜总三萜和奥美拉唑联用(100 mg·kg-1+3.6 mg·kg-1... 详细信息

观察木瓜总三萜和奥美拉唑联用对吲哚美辛诱导胃溃疡大鼠治疗作用,并探寻其可能作用机制。将大鼠随机分为正常组、模型组、奥美拉唑(3.6 mg·kg-1)组、木瓜总三萜(100 mg·kg-1)组、木瓜总三萜和奥美拉唑联用(100 mg·kg-1+3.6 mg·kg-1)组。除正常组外,各组按照20 mg·kg-1灌胃给予吲哚美辛,每天1次,连续7 d,然后灌胃给予相应药物,每天1次,连续14 d。末次给药次日,每组随机选取一半大鼠进行胃黏膜血流量、胃液量测定和血液中TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-4,IL-10含量检测;每组余下大鼠在末次给药后4 h行幽门结扎术,8 h后取胃,收集胃内容物,检测胃内分泌物体积、pH和分泌物总酸度,然后进行胃损伤组织学分析、MPO活性、cAMP含量检测和形态学分析;实时定量PCR法检测TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-4,IL-10,VEGFA,A2AR mRNA表达,Western blot法检测胃组织中VEGFA,A2AR,PKA,p-PKA,CREB,p-CREB,EGF,EGFR,p-EGFR,MUC6,TFF2蛋白表达。结果显示,木瓜总三萜和奥美拉唑联用可显著增加胃黏膜血流量、胃黏液量,降低胃内分泌物体积、分泌物总酸度和黏膜损伤,降低血液和胃组织中TNF-α,IL-1β,IL-6含量和表达,升高IL-4,IL-10含量和表达,抑制胃组织中MPO活性,增加胃组织中cAMP含量,上调胃组织中VEGFA和A2AR mRNA和p-PKA,p-CREB,VEGFA,A2AR,EGF,p-EGFR,MUC6和TFF2蛋白表达,升高p-PKA/PKA,p-CREB/CREB和p-EFGR/EFGR比值,其中木瓜总三萜和奥美拉唑联用治疗效果比两者单用效果更加明显。结果表明木瓜总三萜和奥美拉唑联用对吲哚美辛诱导大鼠胃溃疡有显著治疗作用,其作用机制可能与其调节A2AR/AKT/CREB,A2AR/VEGFA,EGF/EGFR和MUC6/TFF2信号通路,抑制促炎因子生成、增加胃黏膜血流量、上调促进黏膜细胞增殖因子和保护因子蛋白表达有关。

关键词：胃溃疡 A2AR/PKA/CREB,VEGFA/A2AR,EGF/EGFR和MUC6/TFF2信号通路木瓜总三萜奥美拉唑

木瓜总三萜对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠PPARγ/SIRT1/NF-κBp65信号通路及黏膜屏障的影响

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中国中药杂志 2018年第21期43卷 4295-4304页

作者：熊兴军李小妹何毓敏李小琴许海燕冯旻璐贺海波张继红朱姝小松佳子邹坤三峡大学生物与制药学院湖北宜昌443002 长阳县中医医院湖北长阳443001 三峡大学中医医院&宜昌市中医医院湖北宜昌443002 富山大学和漢医薬学総合研究所生薬資源科学分野富山930-0194

观察木瓜总三萜对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠PPARγ/SIRT1/NF-κBp65信号通路及结肠黏膜屏障的影响。将C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、木瓜总三萜(50,100 mg·kg-1)组和柳氮磺吡啶(250 mg·kg-1)组。实验小鼠通过自... 详细信息

观察木瓜总三萜对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导溃疡性结肠炎小鼠PPARγ/SIRT1/NF-κBp65信号通路及结肠黏膜屏障的影响。将C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、木瓜总三萜(50,100 mg·kg-1)组和柳氮磺吡啶(250 mg·kg-1)组。实验小鼠通过自由饮用2.5%DSS诱导溃疡性结肠炎(UC)模型,在自由饮用2.5%DSS前3 d,各给药组灌胃给予相应的药物,正常组和模型组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液,每天1次,连续10 d。每天观察实验小鼠一般状况、记录疾病活动指数(DAI)。末次给药次日,取血,进行血液中TNF-α,IL-1β,IL-6,IFN-γ,IL-4,IL-10含量检测;取结肠进行长度测量、结肠黏膜损伤指数(CMDI)计算、MPO活性检测和组织形态学分析;实时定量PCR法检测结肠组织中E-cadherin,occludin,MUC2,TFF3 mRNA表达,Western blot法检测结肠组织中SIRT1,IKKβ,p-IKKβ,IκBα,p-IκBα及胞浆和胞核中PPARγ,NF-κBp65蛋白表达。结果显示,木瓜总三萜(50,100 mg·kg-1)可显著改善DSS诱导的UC模型小鼠一般状况,降低DAI,CMDI和组织病理学评分,增加结肠长度,减轻结肠黏膜溃疡、糜烂及炎性浸润,恢复黏膜屏障的正常功能,降低血液中促炎因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IFN-γ含量,升高抗炎因子IL-4,IL-10含量,抑制结肠组织中MPO活性,上调结肠组织中黏膜屏障保护因子E-cadherin,occludin,MUC2,TFF3 mRNA表达,下调结肠组织胞浆中PPARγ,组织中p-IKKβ,p-IκBα和胞核中NF-κBp65蛋白表达,降低p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα的比值,上调胞核中PPARγ,组织中SIRT1和胞浆中NF-κBp65蛋白表达(P木瓜总三萜对DSS诱导的小鼠UC有显著治疗作用,其作用机制可能与其调节PPARγ/SIRT1/NF-κBp65信号通路、抑制促炎因子生成、上调肠黏膜屏障保护因子的蛋白表达有关。

关键词：木瓜总三萜溃疡性结肠炎 PPARγ/SIRT1/NF-κBp65信号通路黏膜屏障

木瓜总三萜对幽门螺杆菌诱导小鼠胃炎的保护作用研究

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中国中药杂志 2021年第18期46卷 4782-4792页

作者：石孟琼贺君宇王晓舒恒 NGWA Adeline Ngeng 陈烨韬彭校张继红陈茂华三峡大学医学院湖北宜昌443002 三峡大学生物与制药学院&药食同源大健康产品开发利用宜昌市重点实验室湖北宜昌443002 三峡大学中医临床医学院湖北宜昌443002

观察木瓜总三萜对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)诱导小鼠胃炎保护作用,探寻其可能作用机制。将慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)模型制作成功小鼠随机分为模型组、木瓜总三萜不同剂量(50、100 mg·kg^(-1))组和三... 详细信息

观察木瓜总三萜对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)诱导小鼠胃炎保护作用,探寻其可能作用机制。将慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)模型制作成功小鼠随机分为模型组、木瓜总三萜不同剂量(50、100 mg·kg^(-1))组和三联疗法组,另取未感染Hp C57BL/6J小鼠作为正常组;治疗组小鼠分别给予相应的药物,每日1次,连续4周。然后取血和胃组织进行血液中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、角质细胞趋化因子(keratinocyte chemokines,KC)、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-4、IL-10含量,胃组织中LDH、MPO、SOD、GSH-Px、CAT和MDA活性和含量及血液、胃组织和溶酶体中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B和D活性的检测,HE染色法观察胃组织形态学改变;实时定量PCR法测定胃组织中Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad mRNA表达,Western blot法测定胃组织中TLR4、MyD88、p-IKKβ、p-IκBα、NOD样受体家族3(NOD-like receptor family 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、pro-caspase-1、caspase-1、硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)、pro-IL-1β、pro-IL-18、Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、cytochrome C、凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)、pro-caspase-9、pro-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP-1]、cleaved-PARP-1及胞浆和胞核中NF-κB p65蛋白表达。结果显示,木瓜总三萜可显著抑制Hp增殖,减轻胃黏膜损伤,改善淋巴细胞浸润和腺体萎缩;降低血液、胃组织中β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、组织蛋白酶B和D活性及溶酶体细胞器胞质中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D的活性,升高溶酶体细胞器溶酶体中β-葡萄糖醛酸酶、组织蛋白酶D活性;降低血液中ROS、MCP-1、KC、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和胃组织中MDA含量及MPO、LDH活性,升高血液中IL-4、IL-10含量和胃组织中SOD、CAT和GSH-Px活性;下调胃组织中TLR4、MyD88、Bax、Bad mRNA和蛋白表达,下调胃组织中p-IKKβ、p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、TXNIP、pro-IL-1β、pro-IL-18、cytochrome C、Apaf-1、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP-1和胞核中NF-κB p65蛋白表达,降低p-IKKβ/IKKβ和p-IκBα/IκBα比值;上调胃组织中Bcl-2、Bcl-xl mRNA和蛋白表达,升高Bcl-2/Bax和Bcl-xl/Bad比值,上调胃组织中pro-caspase-9、pro-caspase-3和胞浆中NF-κB p65蛋白表达。以上研究表明木瓜总三萜对Hp诱导小鼠CAG有显著保护作用,其机制可能与增强内源性抗氧化系统功能、抑制Hp诱导CAG小鼠氧化应激、炎症反应、纠正溶酶体功能障碍及TLR4/NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路炎性激活,进而抑制线粒体介导的细胞凋亡有关。

关键词：胃炎炎症反应溶酶体功能 TLR4/NF-κB/NLRP3炎症小体和线粒体凋亡信号通路木瓜总三萜

木瓜总三萜对非甾体抗炎药诱导大鼠小肠损伤的保护作用及机制研究

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中药药理与临床 2018年第5期34卷 55-60页

作者：李小妹贺君宇李爽陈刚张永峰李小琴石孟琼杨文雁张继红三峡大学生物与制药学院宜昌市第一中学三峡大学医学院三峡大学中医医院&宜昌市中医医院宜昌443002

目的:研究木瓜总三萜对非甾体抗炎药(NSAIDs)诱导小肠损伤模型大鼠内源性超氧化物歧化酶/谷胱甘肽过氧化物酶1/过氧化氢酶(SOD/GPX1/CAT)抗氧化系统、细胞外信号调节激酶/核因子2相关因子2/血红素氧合酶-1(ERK/Nrf2/HO-1)和线粒体凋亡... 详细信息

目的:研究木瓜总三萜对非甾体抗炎药(NSAIDs)诱导小肠损伤模型大鼠内源性超氧化物歧化酶/谷胱甘肽过氧化物酶1/过氧化氢酶(SOD/GPX1/CAT)抗氧化系统、细胞外信号调节激酶/核因子2相关因子2/血红素氧合酶-1(ERK/Nrf2/HO-1)和线粒体凋亡信号通路的影响。方法:实验大鼠随机分为正常组、模型组、木瓜总三萜(25、50和100mg/kg)组和雷贝拉唑肠溶片100mg/kg组,各组大鼠灌胃给予相应的药物,每天1次,连续1周,末次给药后禁食,次日再次给药1次; 1小时后,除正常组外,其余各组灌胃给予吲哚美辛45mg/kg 1次。24小时后取血,进行血液中SOD、GSH-Px、CAT和MPO、MDA水平检测;取小肠组织进行溃疡指数和组织形态学分析;实时定量PCR检测小肠组织中SOD1、SOD2、SOD3、GPX1、CAT、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9基因表达; Western blot检测小肠组织中ERK1/2、p-ERK1/2、胞浆Nrf2、胞核Nrf2、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:木瓜总三萜(25、50和100mg/kg)可显著降低吲哚美辛诱导小肠黏膜损伤大鼠小肠溃疡指数、病理学评分,改善小肠黏膜溃疡、黏膜及黏膜下层肿胀和炎性浸润,显著升高血液中内源性抗氧化酶活性,显著上调受损小肠组织中SOD1、SOD2、SOD3、GPX1、CAT和p-ERK1/2、胞核Nrf2、HO-1、Bcl-2表达,显著下调Bax和Caspase-3、Caspase-9表达,且随着剂量的增加,其作用效果更明显。结论:木瓜总三萜对NSAIDs诱导大鼠小肠损伤具有较好的保护作用,调节内源性SOD/GPX1/CAT抗氧化系统功能及ERK/Nrf2/HO-1和线粒体凋亡信号通路可能是其作用机制之一。

关键词：木瓜总三萜非甾体类抗炎药相关性小肠损伤内源性SOD/GPX1/CAT抗氧化系统 ERK/Nrf2/HO-1信号通路线粒体凋亡信号通路

木瓜总三萜通过调节miR-10a和PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导胃癌细胞凋亡

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中药材 2019年第12期42卷 2929-2935页

作者：冯旻璐许海燕贺海波张媛媛江伟杰覃慧林张继红三峡大学生物与制药学院湖北宜昌443002 三峡大学中医医院/宜昌市中医医院湖北宜昌443002

目的:通过观察木瓜总三萜对人胃癌HGC-27细胞株生长的抑制作用,探寻其可能的作用机制。方法:将HGC-27细胞分别单用木瓜总三萜或同转染miR-10a mimic、PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂CCI-779及分别与木瓜总三萜联用处理后,采用MTT和JC-... 详细信息

目的:通过观察木瓜总三萜对人胃癌HGC-27细胞株生长的抑制作用,探寻其可能的作用机制。方法:将HGC-27细胞分别单用木瓜总三萜或同转染miR-10a mimic、PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂CCI-779及分别与木瓜总三萜联用处理后,采用MTT和JC-1法检测细胞活性和线粒体活性,实时定量PCR法检测miR-10a mRNA表达,Western blot法检测HGC-27细胞中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白表达及其磷酸化。结果:木瓜总三萜可显著降低HGC-27细胞活性和线粒体活性,促进细胞凋亡;上调miR-10a mRNA表达,下调p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达及降低p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K比值(P木瓜总三萜具有抑制人胃癌HGC-27细胞线粒体活性和细胞增殖的作用,其机制可能与促进miR-10a表达,抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路激活有关。

关键词：木瓜总三萜胃癌 HGC-27细胞 PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路

木瓜总三萜诱导人胃癌细胞HGC-27凋亡的作用及机制研究

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中药材 2019年第3期42卷 661-665页

作者：李小妹冯旻璐张媛媛李小琴张永峰贺海波三峡大学生物与制药学院

目的:探讨木瓜总三萜诱导的胃癌细胞HGC-27凋亡作用与PI3K/Akt/NAG-1信号通路的关系。方法:MTT法及平板克隆检测木瓜总三萜对HGC-27细胞增殖的影响;显微镜下观察木瓜总三萜处理后细胞形态变化;Hoechst 33258染色检测木瓜总三萜对HGC-27... 详细信息

目的:探讨木瓜总三萜诱导的胃癌细胞HGC-27凋亡作用与PI3K/Akt/NAG-1信号通路的关系。方法:MTT法及平板克隆检测木瓜总三萜对HGC-27细胞增殖的影响;显微镜下观察木瓜总三萜处理后细胞形态变化;Hoechst 33258染色检测木瓜总三萜对HGC-27细胞凋亡形态变化的影响;Western blot检测HGC-27细胞中PI3K/Akt/NAG-1信号通路相关蛋白表达。结果:MTT及平板克隆实验结果表明木瓜总三萜对HGC-27细胞增殖具有抑制作用,其抑制作用随浓度升高及时间延长而增强;木瓜总三萜处理后胃癌细胞其圆梭形态明显变圆漂浮且出现细胞碎片,随着浓度升高越加明显;Hoechst 33258染色结果表明木瓜总三萜可诱导HGC-27细胞凋亡;Western blot检测表明木瓜总三萜各组除Akt蛋白水平无明显变化外,PI3K、p-Akt、NAG-1蛋白表达均显著低于空白对照组(P木瓜总三萜能抑制胃癌细胞HGC-27的增殖,可诱导其凋亡,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/NAG-1信号通路表达有关。

关键词：木瓜总三萜 HGC-27细胞细胞凋亡 PI3K/Akt/NAG-1通路

基于miR-423-5p/TFF1/NAG-1信号通路探讨木瓜总三萜抗吲哚美辛致胃黏膜损伤的分子机制

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基于miR-423-5p/TFF1/NAG-1信号通路探讨木瓜总三萜抗吲哚美辛致...

作者：张永峰三峡大学

学位级别：硕士

目的:围绕miR-423-5p/TFF1/NAG-1信号通路研究该通路信号分子的异常表达与胃黏膜损伤的相互关系;用木瓜总三萜分别干预吲哚美辛致胃黏膜上皮细胞损伤和在佐剂性关节炎模型基础上的胃黏膜损伤动物模型,通过进行细胞凋亡、胃黏膜防御屏障... 详细信息

目的:围绕miR-423-5p/TFF1/NAG-1信号通路研究该通路信号分子的异常表达与胃黏膜损伤的相互关系;用木瓜总三萜分别干预吲哚美辛致胃黏膜上皮细胞损伤和在佐剂性关节炎模型基础上的胃黏膜损伤动物模型,通过进行细胞凋亡、胃黏膜防御屏障、攻击因子和防御因子等相关指标检测及miR-423-5p、TFF1和NAG-1表达水平分析。基于miR-423-5p/TFF1/NAG-1信号通路探讨木瓜总三萜抗炎条件下胃黏膜保护作用的分子机制,为研发无黏膜损伤的新型抗炎药物提供理论基础,同时也为抗炎治疗提供新型候选药物。方法:(1)化学实验部分:选择4种常用的大孔树脂分离纯化木瓜总三萜的性能进行筛选,并用香草醛-冰乙酸的方法对木瓜总三萜的含量进行测定,通过HPLC的方法建立木瓜总三萜的HPLC指纹图谱以对木瓜总三萜进行质量控制。(2)体外实验部分:瞬转法构建miR-423-5p过表达的胃黏膜上皮细胞(GES-1)模型,在此基础上给予吲哚美辛(700μmol/L)刺激,继续培养24h后,采用Real-time PCR法对其转染成功率以及刺激前后miR-423-5p的表达水平进行检测,采用Western Blot法检测TFF1、NAG-1蛋白表达水平以阐明吲哚美辛对miR-423-5p、TFF1、NAG-1表达的影响;应用吲哚美辛(700umol/L)构建胃黏膜上皮细胞损伤模型,用木瓜总三萜(5、10、20mg/m L)干预24h后,用Real-time PCR和Western Blot方法检测miR-423-5p、TFF1、NAG-1的表达水平。(3)体内实验部分:采用弗氏完全佐剂(CFA)足底皮下注射构建Sprague Dawley(SD)大鼠关节炎模型,于致炎后第14天开始分组灌胃给药,1-2组给予生理盐水;第3-5组分别给予木瓜总三萜(12.5、25、50mg/kg);第6组给予吲哚美辛4mg/kg;第7-9组分别给予木瓜总三萜(12.5、25、50mg/kg),给药0.5小时后给予吲哚美辛4mg/kg,连续给药14天,末次给药6h后10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,取胃,取后足关节,HE染色检测大鼠胃黏膜及关节的病理学改变,Western Blot法检测TFF1、NAG-1相关蛋白的表达水平。并于造模前、造模后第3、7、14、21、28天以容积排水法测定大鼠右后足容积,判断大鼠足肿胀程度。结果:(1)通过对4种不同极性大孔树脂的吸附性能进行筛选比对,表明木瓜总三萜适宜选用弱极性的AB-8进行分离纯化,并且最佳乙醇体积分数为70%,采用此方法分离纯化得到的木瓜总三萜的含量可以达到90%;通过对木瓜总三萜样品的HPLC条件进行摸索,建立了木瓜总三萜的HPLC指纹图谱并进行了数据分析,对其特征性峰进行了指认,并通过精密度、稳定性等考察验证了该实验方法的可靠性,为木瓜总三萜的质量控制提供参考。(2)体外实验部分:mimic转染后GES-1细胞中miR-423-5p的表达显著升高,给予吲哚美辛刺激后,miR-423-5p的m RNA表达进一步升高,TFF1的蛋白表达显著降低、NAG-1的蛋白表达显著升高;木瓜总三萜能够降低吲哚美辛致胃黏膜上皮细胞GES-1损伤模型中miR-423-5p的m RNA表达水平,升高TFF1的蛋白表达水平,降低NAG-1的蛋白表达水平,并呈明显的剂量依耐性。(3)体内实验部分:大鼠足底皮下注射CFA 8h后足趾关节出现明显的红肿,大鼠活动受限,并呈现进行性加重,2天左右达到峰值,此后大鼠症状逐渐减轻,2周后大鼠后足再发肿胀,此时给予木瓜三萜治疗,木瓜三萜组与木瓜总三萜、吲哚美辛联用组均能显著降低佐剂性关节炎大鼠的足肿胀度,但二者之间未见显著性差异;大鼠后足踝关节HE染色结果显示,正常组大鼠的HE染色切片,可以看到干净清晰的关节腔,滑膜完整。滑膜组织中无炎性细胞浸润,无纤维组织增生,关节软骨表面光滑,骨纤维整齐排列;关节炎模型组大鼠可见关节腔积液,炎性渗出,软骨组织部分缺损,滑膜细胞增生水肿,血管翳形成,滑膜组织内小血管增生,扩张充血,大量炎细胞浸润,木瓜三萜治疗组较模型组相比均有不同程度的减轻;大鼠胃组织宏观结果显示,正常组大鼠胃黏膜完整光滑,表面黏液覆盖,无充血、水肿以及溃疡;胃溃疡模型组大鼠与木瓜总三萜低剂量组(12.5mg/kg)大鼠胃粘膜有广泛损伤,水肿、充血、糜烂,并见大量散在出血点及出血条带。25和50mg/kg木瓜总三萜剂量组出血点及出血条带有不同程度的减轻。胃组织HE染色结果显示,正常组大鼠胃黏膜完整,腺体排列整齐,黏膜层结构清楚。单层柱状上皮细胞排列整齐紧密,上覆黏液。胃溃疡模型组与木瓜总三萜低剂量组(12.5mg/kg)可观测到大量溃疡面,25和50mg/kg木瓜总三萜剂量组未见明显的溃疡面,但

关键词：非甾体抗炎药木瓜总三萜胃黏膜损伤 miR-423-5p 三叶因子1 非甾体抗炎药活化基因