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木尔坦棉花曲叶病毒编码的V2蛋白特征分析

木尔坦棉花曲叶病毒编码的V2蛋白特征分析

作者：陈思敏西南大学

学位级别：硕士

木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)是一种重要的粉虱传双生病毒,在自然条件下主要由烟粉虱(Bemisia tabaci)以持久循回方式传播。CLCuMuV最早在巴基斯坦木尔坦地区发现,之后扩散到巴基斯坦其他地区及印度等地... 详细信息

木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)是一种重要的粉虱传双生病毒,在自然条件下主要由烟粉虱(Bemisia tabaci)以持久循回方式传播。CLCuMuV最早在巴基斯坦木尔坦地区发现,之后扩散到巴基斯坦其他地区及印度等地,给当地的棉花等作物生产造成了惨重的损失。2006年CLCuMuV首次在我国广东朱槿上发现危害,之后陆续在广西、福建、海南、江苏等地发现并报道,成为我国朱槿、黄秋葵、棉花等多种园艺和经济作物安全生产上的重大风险因子之一。CLCuMuV属于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的单组分双生病毒,其基因组为一个单链环状DNA(DNA-A),同时伴随一个β卫星分子CLCuMuB(Cotton leaf curl Multan betasatellite,CLCuMuB)。其中DNA-A包含6个ORF,分别编码V1(CP)、V2、C1(Rep)、C2(TrAP)、C3(REn)和C4蛋白,β卫星只编码一个蛋白(βC1)。许多双生病毒编码的V2蛋白具有参与症状形成、帮助病毒运动、抑制基因沉默等多种功能,在病毒侵染及致病过程中起着重要的作用。目前对于我国CLCuMuV的分离物编码的V2蛋白功能研究还相对较少,因此本研究选择我国发生的CLCuMuV的V2蛋白作为主要研究对象,对其在亚细胞定位、致病性及其在病毒与寄主互作过程中的作用方式进行了研究,以期初步解析V2蛋白在病毒致病等过程的作用机理,为进一步阐明CLCuMuV的致病机理及其在我国发生成灾的机制奠定基础。本研究选择2012年采自江苏南京的CLCuMuV朱槿(Hibiscus rosa-sinensis)分离物作为研究对象,对其编码V2基因进行了扩增及克隆,获得了完整的V2序列,编码蛋白序列分析结果显示:本研究选择的V2序列与我国其他分离物之间高度同源,而与巴基斯坦、印度等地的分离物同源性相对较低,暗示了本研究的结果将不仅有助于解释CLCuMuV江苏分离物编码V2的功能特征,对我国其他分离物编码V2的功能解析也将有裨益,同时也说明针对我国分离物展开研究将更有助于该病毒在我国发生特点的解析。为了进一步研究V2蛋白的特征,我们构建了带有YFP标签的V2表达载体V2-YF P,利用农杆菌浸润法接种本氏烟(Nicotiana benthamiana),激光共聚焦显微镜进行观察,结果显示浸润处理40小时后(40hpi)本氏烟叶片细胞的细胞质及细胞核周都有较强的绿色荧光信号,同时在细胞质还分布有点状的荧光信号,反转录PCR(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(Western blot)结果显示带荧光标签的V2在本氏烟叶片中转录和表达正常。这些结果说明CLCuMuV编码的V2蛋白主要分布在细胞质和细胞核周,同时在细胞质还会形成多聚小体,这些特征可能与其在病毒运动及致病过程中的角色相关。在粉虱传双生病毒中,很多研究结果显示病毒编码蛋白之间有时会通过互作行使不同的功能,为了明确V2是否与CLCuMuV编码的其他蛋白之间存在互作,我们对其6个基因(V1、V2、C1、C2、C3、C4)进行了克隆并分别构建了酵母双杂交载体,进一步酵母双杂交实验结果显示V2与V1、C1、C2、C3、C4之间都不存在互作,但V2自身存在互作,暗示了V2可能以不同的聚合形式参与了不同功能的行使。为了进一步解析V2自身互作的方式,我们对V2蛋白的功能域进行了预测,并构建了3个缺失型突变体,利用酵母双杂交实验进行了验证,结果发现1-78 aa这一区段是其互作的关键区段。病毒在侵染寄主的过程中,除病毒编码蛋白外,还需要很多寄主因子的参与,为了解析V2在病毒与寄主互作中的作用方式,我们对前期获得的一个棉花基因进行了克隆,并对其序列进行了分析,结果显示这是一个40S核糖体蛋白(ribosomal protein S20,R PS20)。为了验证其在病毒与寄主互作的过程中的作用,我们构建了酵母双杂交载体,并利用酵母双杂交系统对其与病毒编码的6个蛋白之间的互作进行了验证,结果发现V2与RPS20存在弱互作,暗示了V2可能通过调控寄主RPS20参与了病毒与寄主间的互作。本研究选择CLCuMuV江苏分离物编码的V2蛋白为主要研究对象,对其亚细胞定位、致病性、互作相关因子等特征进行了研究,结果发现V2主要分布在细胞质及细胞核周、V2自身存在互作,其1-78 aa区段是其关键互作区段,同时还发现V2与寄主的一个核糖体蛋白RPS20之间存在互作,这些结果为进一步研究CLCuMuV编码的V2蛋白功能提供了前期研究基础,为更深入地解析CLCuMuV的致病机理奠定了基础。

关键词：木尔坦棉花曲叶病毒 V2蛋白亚细胞定位酵母双杂交互作

侵染朱槿的木尔坦棉花曲叶病毒V2蛋白的亚细胞定位特征分析

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园艺学报 2018年第12期45卷 2417-2426页

作者：陈思敏季英华吴根土赵文浩吴淑华肖留斌孙现超周益军青玲西南大学植物保护学院植物病害生物学重庆市高校级重点实验室重庆400716 江苏省农业科学院植物保护研究所江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培养基地南京210014

木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)2006年在中国首次报道,并呈逐年扩散蔓延,给园艺和经济作物造成了严重损失。选择2012年采自江苏南京的CLCuMuV朱槿(Hibiscus rosa-sinensis)分离物作为研究对象,对其V2蛋白... 详细信息

木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)2006年在中国首次报道,并呈逐年扩散蔓延,给园艺和经济作物造成了严重损失。选择2012年采自江苏南京的CLCuMuV朱槿(Hibiscus rosa-sinensis)分离物作为研究对象,对其V2蛋白基因进行了扩增及克隆,并构建了V2-YFP融合表达载体,利用农杆菌浸润法接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)。激光共聚焦显微镜观察结果显示浸润处理后本氏烟叶片细胞的细胞质和细胞核周都有较强的绿色荧光信号,同时细胞质中还分布有点状的荧光信号。反转录PCR(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(Westernblot)结果显示带荧光标签的V2在本氏烟叶片中转录和表达正常。这些结果说明CLCuMuV编码的V2蛋白主要分布在细胞质和细胞核周,同时在细胞质中还会形成小聚合体。

关键词：朱槿木尔坦棉花曲叶病毒 V2蛋白亚细胞定位

侵染朱槿的木尔坦棉花曲叶病毒及其卫星DNA全基因组结构特征

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病毒学报 2008年第1期24卷 64-68页

作者：毛明杰何自福虞皓李华平广东省农业科学院植物保护研究所广州510640 华南农业大学植物病毒研究室广州510642

从广州朱槿上分离到病毒分离物G6,全序列测定结果表明,G6DNA-A全长为2737个核苷酸。序列比较显示,G6DNA-A与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)各分离物的同源率均大于89%,其中与CLCuMV-[62]的同源率最高(96.1%),与拉贾斯坦棉花曲叶病毒(CLCuRV... 详细信息

从广州朱槿上分离到病毒分离物G6,全序列测定结果表明,G6DNA-A全长为2737个核苷酸。序列比较显示,G6DNA-A与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)各分离物的同源率均大于89%,其中与CLCuMV-[62]的同源率最高(96.1%),与拉贾斯坦棉花曲叶病毒(CLCuRV)的同源率87.1%～89.8%,而与其他菜豆金色花叶病毒属病毒同源率均在87%以下。DNA-A系统进化关系分析显示,G6与CLCuMV各分离物的亲缘关系最近,聚在一起形成一个分支,而与其他几种双生病毒的亲缘关系相对较远。利用DNAβ特异引物β01和β02,从G6中扩增到卫星DNA分子(DNAβ)。序列分析结果表明,G6DNAβ全长1346个核苷酸,推导其互补链上编码一个ORF(C1)。序列比较结果表明,G6DNAβ与CLCuMV DNAβ的同源率最高(92.1%),与CLCuRV DNAβ的同源率为88.7%,而与其他已报道的DNAβ的同源率均在80%以下。DNAβ系统进化关系分析显示,G6DNAβ与CLCuMV DNAβ形成一个独立的分支,再与CLCuRV及MYVV-[Y47]的DNAβ形成一个较大分支。从上述研究结果可以得出,侵染广东朱槿的病毒分离物G6应该是CLCuMV一个分离物。

关键词：木尔坦棉花曲叶病毒朱槿卫星DNAβ Begomovirus

江苏朱槿上分离到的木尔坦棉花曲叶病毒基因组结构特征分析

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植物病理学报 2015年第4期45卷 361-369页

作者：张晖季英华吴淑华赵文浩周彤周益军南京农业大学植物保护学院南京210095 江苏省农业科学院植物保护研究所南京210014

2012年5月,江苏南京朱槿上出现一种新的病毒病害,病株表现明显的叶片上卷、叶脉肿大、叶背伴有耳突、植株矮缩等症状。根据其症状及介体发生状况,对其伴随的病毒种类进行研究,结果发现采集的46份典型症状样品体内均可以检测到粉虱传双... 详细信息

2012年5月,江苏南京朱槿上出现一种新的病毒病害,病株表现明显的叶片上卷、叶脉肿大、叶背伴有耳突、植株矮缩等症状。根据其症状及介体发生状况,对其伴随的病毒种类进行研究,结果发现采集的46份典型症状样品体内均可以检测到粉虱传双生病毒,对其基因组DNA-A组分克隆测序后发现其全长2 736 bp,编码6个ORF,BLAST分析显示该病毒与木尔坦棉花曲叶病毒同源性最高(99.9%),是木尔坦棉花曲叶病毒的一个分离物。病样中同时还检测到伴随DNAβ卫星分子,测序结果显示该卫星全长1 346 bp,编码1个ORF,BLAST及聚类分析结果显示该β卫星与木尔坦棉花曲叶病毒β卫星同源性最高(99.7%),为木尔坦棉花曲叶病毒β卫星的一个分离物。这是木尔坦棉花曲叶病毒首次在长江流域的报道。

关键词：木尔坦棉花曲叶病毒朱槿 β卫星江苏

侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆构建及致病性测定

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植物病理学报 2015年第2期45卷 198-204页

作者：顾周杭胡高洁谢艳周雪平浙江大学农业与生物技术学院生物技术所杭州310058

从广东广州扶桑和广西南宁棉花中分离得到木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)的2个分离物GD37和GX01,序列分析表明两分离物的基因组全序列同源性为99.4%,卫星分子序列同源性为99.2%。构建了GD37和GX01的侵染性克... 详细信息

从广东广州扶桑和广西南宁棉花中分离得到木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)的2个分离物GD37和GX01,序列分析表明两分离物的基因组全序列同源性为99.4%,卫星分子序列同源性为99.2%。构建了GD37和GX01的侵染性克隆,农杆菌接种表明CLCuMV GD37能侵染本氏烟、心叶烟、三生烟、普通烟,GD37和GD37β共同接种产生叶片下卷、植株矮化等症状,但不能侵染棉花、番茄、矮牵牛;而分离自棉花的CLCuMV GX01能够侵染本氏烟,GX01和GX01β共同接种在本氏烟上产生叶片下卷皱缩等症状,但不能侵染棉花。Southern-blot结果表明在GD37单独侵染或与GD37β共同侵染的植株中均能检测到相应DNA分子的积累。

关键词：木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆致病性

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传播木尔坦棉花曲叶病毒的烟粉虱隐种鉴定

植物保护学报 2016年第1期43卷 91-98页

作者：陈婷汤亚飞赵蕊何自福吕利华广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

为明确广东地区传播木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus,CLCu Mu V）的烟粉虱隐种,采用分子鉴定、烟粉虱传毒试验与分子检测的方法,对传播CLCu Mu V的烟粉虱隐种进行了鉴定。结果表明：在广东棉花、红麻和黄秋葵曲叶病... 详细信息

为明确广东地区传播木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus,CLCu Mu V）的烟粉虱隐种,采用分子鉴定、烟粉虱传毒试验与分子检测的方法,对传播CLCu Mu V的烟粉虱隐种进行了鉴定。结果表明：在广东棉花、红麻和黄秋葵曲叶病发生的田间,2014年采集的30头烟粉虱mt COI与Asia II 7隐种序列同源性为98.3%~99.6%,2015年采集的10头烟粉虱中,8头烟粉虱mt COI与MEAM1隐种序列同源性为99.2%~99.5%,2头烟粉虱mt COI与Asia II 7隐种序列同源性为99.8%~99.9%,说明烟粉虱种群包括入侵隐种MEAM1和土著隐种Asia II 7。在利用烟粉虱人工传毒试验中,MEAM1、Asia II 7和Asia II 1这3个隐种均可在棉花曲叶病株上饲毒获得CLCu Mu V及β卫星分子;除MEAM1隐种外,Asia II 7、Asia II 1隐种可传播CLCu Mu V,侵染红麻及黄秋葵植株引起曲叶病,前者传毒效率分别为50%和100%;而后者为33%和100%。以上3个烟粉虱隐种传毒接种棉花未见成功。

关键词：木尔坦棉花曲叶病毒烟粉虱隐种传毒

侵染广东黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒及伴随卫星DNA的分子特征

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华南农业大学学报 2012年第1期33卷 33-39页

作者：董迪朱艳华何自福柴兆祥佘小漫罗方芳广东省农业科学院植物保护研究所广东广州510640 甘肃农业大学草业学院甘肃兰州730070

从广东省表现黄脉曲叶的黄秋葵病株上分离到病毒分离物Okra06,PCR检测结果显示,该病毒属双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus.基因克隆及序列分析结果表明,其基因组仅含A组分(DNA-A),全长为2 737 nt,推导编码6个开放... 详细信息

从广东省表现黄脉曲叶的黄秋葵病株上分离到病毒分离物Okra06,PCR检测结果显示,该病毒属双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus.基因克隆及序列分析结果表明,其基因组仅含A组分(DNA-A),全长为2 737 nt,推导编码6个开放阅读框(Open reading frame,ORF).该组分与木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leafcurl Multan virus,CLCuMV)分离物G6的核苷酸序列相似性最高,为99.7%;二者编码的6个ORF相似性分别为100%、100%、99.6%、99.8%、100%和99.7%.该病毒还伴随有卫星分子β(DNAβ),全长为1 346 nt,推导其互补链上编码1个ORF(C1).该分子与伴随CLCuMV分离物G6 DNAβ的核苷酸序列相似性也最高(99.5%).DNAβ系统进化分析显示,Okra06 DNAβ与CLCuMV-[G6]DNAβ、CLCuMV-[Gx08]DNAβ亲缘关系最近,三者形成一个独立分支;进一步与其他CLCuMV DNAβ和CLCuV DNAβ聚类在一起.这些结果证明,侵染广东黄秋葵的病毒分离物Okra06属于CLCuMV,且该分离物与引起广东朱槿曲叶病的CLCuMV-G6应同属木尔坦棉花曲叶病毒朱槿株系.

关键词：黄秋葵黄脉曲叶病木尔坦棉花曲叶病毒 DNA—A 卫星DNA β

侵染垂花悬铃花的木尔坦棉花曲叶病毒分子特征研究

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植物病理学报 2013年第2期43卷 120-127页

作者：汤亚飞何自福杜振国韩利芳佘小漫罗方芳广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

垂花悬铃花曲叶病是近期在广东发现的一种新病害,病株表现为叶片向上卷曲,叶脉肿大,叶脉变深绿色等症状。PCR检测结果显示,该病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒分离物(GD11)DNA-A全长为2 737 nt,... 详细信息

垂花悬铃花曲叶病是近期在广东发现的一种新病害,病株表现为叶片向上卷曲,叶脉肿大,叶脉变深绿色等症状。PCR检测结果显示,该病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒分离物(GD11)DNA-A全长为2 737 nt,具有菜豆金色花叶病毒属病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,编码6个ORFs;该序列与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)各分离物序列的相似性均大于89.0%,其中与G6、Okra06及GX1等分离物序列的相似性大于99.0%。该病毒分离物也伴有卫星DNAβ分子,其全长为1 348 nt,与CLCuMV各分离物的DNAβ序列相似性大于85.0%,其中与G6、Okra06及GX1等DNAβ的序列相似性均大于99.0%。因此,侵染广东垂花悬铃花的病毒分离物属于CLCuMV,且与入侵我国的朱槿分离物G6、黄秋葵分离物Okra06及棉花分离物GX1亲缘关系很近。本文首次报道了CLCuMV及其卫星β复合侵染垂花悬铃花。

关键词：垂花悬铃花曲叶病木尔坦棉花曲叶病毒 DNA—A 卫星DNAβ

我国46个棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒的抗性鉴定

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植物保护学报 2017年第4期44卷 601-608页

作者：汤亚飞何自福佘小漫蓝国兵广东省农业科学院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

为明确我国主要棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)的抗性水平,采用烟粉虱田间自然传毒和CLCuMuV侵染性克隆人工接种方法分别对收集的46个棉花品种进行抗性鉴定。结果显示:46个棉花品种田间播种后90... 详细信息

为明确我国主要棉花品种对木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMuV)的抗性水平,采用烟粉虱田间自然传毒和CLCuMuV侵染性克隆人工接种方法分别对收集的46个棉花品种进行抗性鉴定。结果显示:46个棉花品种田间播种后90 d,新海21号、新海31号、新37号及112-2号4个品种自然发病的病株率为41.70%~100.00%,病情指数为39.81~100.00;新陆早36号、新陆中52号、中棉35号、中棉43号、鲁棉研36号、金宏祥10号6个品种的病株率为8.30%~16.70%,病情指数为0.93~9.26;其余品种未见发病。46个棉花品种人工接种CLCuMuV后60 d,新海21号、新海31号、新海37号和112-2号4个品种的病情指数为75.00~100.00,表现为高感;新陆中66号和新陆早46号病情指数分别为20.83和20.37,表现为中感;新陆早62号等10个品种的病情指数为10.46~15.87,表现为中抗;新陆早47号等14个品种的病情指数为5.26~9.26,表现为抗病;豫棉15号等11个品种的病情指数为2.22~4.86,表现为高抗;新陆早13号、新陆早61号、新陆中32号、新陆中56号和中棉41号病情指数均为0,表现为免疫。

关键词：棉花品种木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆农杆菌注射接种抗性鉴定