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旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的克隆与表达

旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的克隆与表达

作者：王峰郑州大学

学位级别：硕士

旋毛虫病是一种严重的人兽共患病，可感染人及150多种动物，呈世界性分布。近年来在我国17个省、市、自治区发现有多起人体感染的暴发流行。河南省为我国旋毛虫病高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发流行，发病400多人。若不及时诊断和... 详细信息

旋毛虫病是一种严重的人兽共患病，可感染人及150多种动物，呈世界性分布。近年来在我国17个省、市、自治区发现有多起人体感染的暴发流行。河南省为我国旋毛虫病高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发流行，发病400多人。若不及时诊断和治疗，患者死亡率可高达3％～30％。因而旋毛虫成为我国肉食品卫生检验中的首检寄生虫，开展旋毛虫病的预防和控制工作在我国更具紧迫性和重要性，而预防和控制旋毛虫病的关键在于建立一套快速、简便、特异性高的检测手段以及采取各种有效预防措施降低动物感染率。目前对旋毛虫病尚无满意的诊断方法，病原学检查检出率低且不易为患者接受。国内外学者对旋毛虫病的免疫学诊断进行了大量的研究，但所用的诊断抗原多为旋毛虫肌幼虫虫体粗抗原，由于抗原成分复杂，用于本病的免疫学诊断时常与其它寄生虫病发生交叉反应而出现假阳性。对旋毛虫病的免疫预防的研究表明，由于旋毛虫在不同的发育期虫体抗原组分存在明显的差异且同一期虫体抗原结构也极其复杂，且在其长期的寄生生活中，逐渐形成了免疫逃避机制，目前采用成份复杂的虫体抗原往往难以取得理想的免疫预防效果且极不稳定，而且旋毛虫的体外培养仍未取得突破，这都为大规模采用常规免疫方法防治带来了困难。随着分子生物学技术的发展，使得旋毛虫抗原的体外表达成为可能。与常规抗原相比，基因工程抗原具有纯度高、成分单一、易于大规模生产等优势，为旋毛虫病的免疫诊断和免疫预防提供了新的手段。旋毛虫病的有效诊断和预防的关键为特异性高、保护性强抗原基因的获得，其重要的有效途径之一为构郑州大学川们年硕士论文旋毛虫5 日龄成虫期特异性基因的分子克隆与表达一建CDNA文库，从中筛选理想的抗原基因。目前利用基因工程方法对旋毛虫的大部分研究主要集中在肌幼虫抗原，由于肌幼虫期是旋毛虫在宿主体内产生免疫逃避最长的时期，形成囊包后可长期寄生于宿主体内，其生命活动处于相对休眠状态，基本不需要表达蛋白，因而其mRNA含量低，所建的文库有效重组子较少，难以筛选到目的基因。据报道，从旋毛虫肌幼虫 C DNA文库中筛选到的克隆编码蛋白抗原的效果并不理想，而成虫期和新生幼虫期是旋毛虫的两个侵袭期，特别是5日龄成虫u L 在其生活史中是旋毛虫的一个特殊时期，在雌性成虫的子宫内含有大量幼虫胚胎，并有少量幼虫排出体外。此期虫体代谢极度旺盛，需要在短时间内合成大量期特异性蛋白，而且其分泌的侵袭因于很可能为ADS与肌幼虫相比所特有的致病因子和强保护性抗原，对宿主免疫作用极为敏感。因此，可以通过构建高质量的 ADS CDNA文库来筛选出其差异性表达北期特异性）的功能性抗原基因，利用基因工程技术将其克隆入载体，并大量表达出有效的单一纯化抗原，对于旋毛虫病的免疫诊断和预防具有重要意义。材料与方法本实验在己构建好的ADS差减文库的基础上，应用放射性同位素Q／中标记ADS差减文库CDNA片段T671进行SOLlthCC杂交、探针鉴定，利用地高辛标记此期特异性片段，采用两步噬菌斑原位杂交从 ADS CDNA文库中调取其全长CDNA，登陆国际NCBI数据库进行同源性检索及编码蛋白相似性比较。登陆 InterProscan进行氨基酸序列分析。利用信号肽序列分析软件mignal vZ刀）分析预测 XZI编码蛋白的信号肽区域。应用蛋白序列分析软件包 ANTHEPROT4．3分析用1编码蛋白的组成并对其二级结构。亲水性、抗原性及等电点进行预测。根据测序及对 XZI编码蛋白分析结果，考虑到信号肽序列可能对基因的原核表达有影响，利用 ECORI在全长序列的 170 hp处将基因信号肽序列切去。根据未切信号肽序列与去信号肽序列的读码框架，同时分别克隆入表达载体PET28P，构建其原核表达载体PET28K比x、PET28－XZlex。将重组质粒克隆人大肠杆菌DHSA，筛选出阳性克隆，对阳性克隆经酶切鉴定、测序鉴定。经 2郑州大学川0丰硕士

关键词：旋毛虫5日龄成虫期特异性基因筛选表达

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旋毛虫期特异性基因的筛选与鉴定

中国畜牧兽医 2007年第10期34卷 68-70页

作者：姚春雨汪明中国农业大学动物医学院

对旋毛虫新生幼虫期特异性基因进行筛选与鉴定,结果表明:对新生幼虫cDNA文库进行核酸杂交筛选,获得7个阳性克隆,其大小在1.4 kb左右;用放射性同位素α-32P标记cDNA探针后,与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼虫、成虫/新生幼虫cDNA文库质粒DN... 详细信息

对旋毛虫新生幼虫期特异性基因进行筛选与鉴定,结果表明:对新生幼虫cDNA文库进行核酸杂交筛选,获得7个阳性克隆,其大小在1.4 kb左右;用放射性同位素α-32P标记cDNA探针后,与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼虫、成虫/新生幼虫cDNA文库质粒DNA进行Southern印迹杂交,结果与成虫/新生幼虫、新生幼虫cDNA文库质粒DNA有杂交而与成虫、肌幼虫cDNA文库质粒DNA不杂交,因此该探针是新生幼虫期所特有的cDNA片段。

关键词：旋毛虫期特异性基因筛选鉴定

旋毛虫新生幼虫期特异性基因糖蛋白表达载体的构建

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塔里木农垦大学学报 2002年第3期14卷 1-4页

作者：徐晓立刘明远卢强任瑞文塔里木农垦大学动物科技学院新疆阿拉尔843300 解放军军需大学动科系吉林长春130062 广州军区连勤部军事医学研究所广东广州510507

根据旋毛虫新生幼虫 (NBL)期特异性全长cDNASSC1基因序列 ,PCR扩增目的基因 ,克隆入pMD18T后 ,根据其读码框架 ,克隆入表达载体pET2 8b ,构建其原核表达载体pET2 8b -SSC1。分别用SalI和XhoI、SmaI和HindIII双酶切 ;XbaI单酶切鉴定重组... 详细信息

根据旋毛虫新生幼虫 (NBL)期特异性全长cDNASSC1基因序列 ,PCR扩增目的基因 ,克隆入pMD18T后 ,根据其读码框架 ,克隆入表达载体pET2 8b ,构建其原核表达载体pET2 8b -SSC1。分别用SalI和XhoI、SmaI和HindIII双酶切 ;XbaI单酶切鉴定重组子 ,结果均与预期相符 ,进一步测序结果也表明重组载体读码框架正确。

关键词：糖蛋白表达载体旋毛虫新生幼虫期特异性基因旋毛虫病

旋毛虫新生幼虫cDNA文库构建及其特异性基因的筛选与鉴定

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中国兽医杂志 2008年第8期44卷 5-7页

作者：姚春雨汪明孙国权中国农业大学动物医学院北京海淀100193 内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028042

构建旋毛虫新生幼虫cDNA文库并对旋毛虫新生幼虫期特异性基因进行筛选与鉴定，筛选出期特异性的基因片段。用λZAPⅡ Express载体成功地构建了旋毛虫新生幼虫的cDNA文库，并用放射性同位素α-33P标记cDNA探针对筛选出的阳性克隆进行鉴... 详细信息

构建旋毛虫新生幼虫cDNA文库并对旋毛虫新生幼虫期特异性基因进行筛选与鉴定，筛选出期特异性的基因片段。用λZAPⅡ Express载体成功地构建了旋毛虫新生幼虫的cDNA文库，并用放射性同位素α-33P标记cDNA探针对筛选出的阳性克隆进行鉴定。所构建的cDNA文库容量为1．92×10^6，重组效率为98．6％，所有的克隆片段都在0．5～2．0kb之间，筛选获得7个阳性克隆，其大小在1．4kb左右；用放射性同位素α-32P标记cDNA探针后，与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼虫及成虫／新生幼虫cDNA文库质粒DNA进行Southern印迹杂交，结果与新生幼虫和成虫、新生幼虫cDNA文库质粒DNA有杂交而与成虫、肌幼虫cDNA文库质粒DNA不杂交。该基因是新生幼虫期所特有的cDNA片段。

关键词：旋毛虫 cDNA文库期特异性基因筛选鉴定

旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的克隆与分析

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旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的克隆与分析

作者：高长玲吉林大学

学位级别：硕士

本研究利用旋毛虫新生幼虫期特异性基因N5 cDNA 作为探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA 文库进行核酸杂交筛选,将阳性克隆全部送测序公司测序。将测序结果进行序列分析,95 个阳性克隆均含信号肽,属于分泌蛋白;且根据信号肽不同共分为15 种基因... 详细信息

本研究利用旋毛虫新生幼虫期特异性基因N5 cDNA 作为探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA 文库进行核酸杂交筛选,将阳性克隆全部送测序公司测序。将测序结果进行序列分析,95 个阳性克隆均含信号肽,属于分泌蛋白;且根据信号肽不同共分为15 种基因,其中13 种基因均为旋毛虫未知基因序列。InterProScan 检索表明15 种氨基酸序列均编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ,含有脱氧核糖核酸酶Ⅱ的保守序列。应用PCR 技术,将旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10 的信号肽去除后,重组到原核表达载体pET-28a,将重组质粒依次转入克隆菌NovaBlue 与表达菌BL21star(DE3),用IPTG 诱导培养重组表达菌进行原核高效表达。并将N10 重组蛋白提取包涵体,并对其可溶性蛋白酶的活性作初步鉴定。本实验成功地对旋毛虫新生幼虫cDNA 文库进行核酸杂交筛选,获得旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族;将具有代表性的基因N10 克隆到原核表达载体上,在大肠杆菌中进行高效表达;并将N10表达的融合蛋白酶的活性进行初步鉴定,达到预期结果。

关键词：旋毛虫期特异性基因脱氧核糖核酸酶Ⅱ 克隆表达

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旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因的结构与功能分析

生物技术 2003年第1期13卷 2-4页

作者：徐晓立任瑞文卢强刘明远新疆塔里木农垦大学动科院新疆阿拉尔843300 解放军军需大学动科系吉林长春130062

目的 :运用生物信息学原理 ,对由旋毛虫新生幼虫 (NBL)差减文库调取的新生幼虫期特异性基因进行分析。方法 :通过对BLASTn核酸数据库及BLASTp蛋白数据库的相似性检索 ,登陆PROSITE数据库进行蛋白位点和序列模式分析 ,并采用AN THEPROT ... 详细信息

目的 :运用生物信息学原理 ,对由旋毛虫新生幼虫 (NBL)差减文库调取的新生幼虫期特异性基因进行分析。方法 :通过对BLASTn核酸数据库及BLASTp蛋白数据库的相似性检索 ,登陆PROSITE数据库进行蛋白位点和序列模式分析 ,并采用AN THEPROT 4 3软件包对其理化特性进行分析。结果 :相似性检索及序列模式分析显示 ,该基因为胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的编码基因 ,并对其编码蛋白的理化特性 ,疏水性、抗原性、信号肽及其二级结构进行了预测。登陆SWISS -MODEL自动蛋白质同源模建服务器 ,搜索、优化后预测了其 3D结构模型。结论 :该期特异性基因为旋毛虫新生幼虫胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的编码基因。

关键词：功能分析旋毛虫新生幼虫期特异性基因疏水性蛋白结构预测

基于加权共表达网络分析挖掘牦牛毛囊不同发育阶段的关键调控基因

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基于加权共表达网络分析挖掘牦牛毛囊不同发育阶段的关键调控基因

旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库的构建及其初步筛选

第九届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：张哓兰裴杰郭宪叶娜王兴东包鹏甲阎萍中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃省牦牛繁育工程重点实验室

目的牦牛被毛的季节性周期生长和脱落对其适应高原极端环境具有重要意义。本研究利用加权共表达网络分析(WGCNA)的方法分析牦牛毛囊周期发育的时期特异性基因表达模块,并挖掘关键模块的hub基因,为阐明牦牛毛囊周期发育的机制提供理论依据。

关键词：共表达网络期特异性基因 WGCNA 分析挖掘不同发育阶段

来源： cnki会议评论

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中国兽医学报 2001年第4期21卷 355-358页

作者：刘明远黎诚耀吴秀萍 JFFabien 付宝权 CTrap 卢强张西臣 PBoireau 解放军军需大学动物科技系吉林长春130062 法国食品安全局分子生物学实验室

利用差减杂交 (减法杂交 ,subtractive hybridization)技术 ,以旋毛虫新生幼虫 ( newborn larvae,NBL)的 c DNA作为试验方 ( tester) ,以肌幼虫 +成虫的 c DNA作为驱动方 ( driver) ,制备新生幼虫差减 c DNA;利用 T载体构建 NBL差减 c ... 详细信息

利用差减杂交 (减法杂交 ,subtractive hybridization)技术 ,以旋毛虫新生幼虫 ( newborn larvae,NBL)的 c DNA作为试验方 ( tester) ,以肌幼虫 +成虫的 c DNA作为驱动方 ( driver) ,制备新生幼虫差减 c DNA;利用 T载体构建 NBL差减 c DNA文库 ,获克隆株 90个。以试验方的差减 c DNA第 2次 PCR产物 +未差减c DNA为试验方探针 ,以驱动方的差减 c DNA第 2次 PCR产物 +未差减 c DNA为驱动方探针 ,在 NBL差减c DNA文库中初筛 NBL的期特异性克隆 ,获初筛克隆 2 4个。这些初筛期特异性克隆进一步用 Southern blot确认鉴定 ,获真阳性期特异性克隆 2个 ( NBL SSC1 ,NBL SSC2 )。DNASIS以及 Blaster的分析结果显示 ,这2个克隆为旋毛虫的 2个新基因 ,其中 NBL SSC1编码糖蛋白 ,NBL SSC2编码丝氨酸蛋白酶。本试验为旋毛虫期特异性基因全长序列的调取、分析。

关键词：旋毛虫新生幼虫期特异性基因差减文库 cDNA文库

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旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ表达及鉴定

旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ表达及鉴定

作者：龙民慧吉林大学

学位级别：硕士

对本实验室通过筛选旋毛虫新生幼虫差减cDNA 文库所获得的新生幼虫期特异性表达基因N5(基因库注册号为:AF331159)进行Interproscan 检索,发现N5 可能编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)。构建原核表达载体pET28a-N5。将重组质粒pET28a-N5 ... 详细信息

对本实验室通过筛选旋毛虫新生幼虫差减cDNA 文库所获得的新生幼虫期特异性表达基因N5(基因库注册号为:AF331159)进行Interproscan 检索,发现N5 可能编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)。构建原核表达载体pET28a-N5。将重组质粒pET28a-N5 放入表达菌*** BL21 (DE3)。用IPTG 在不同的表达条件(不同温度、IPTG 浓度、细菌的OD 值)对重组表达菌BL21 (DE3)进行诱导,对菌体裂解物进行SDS-PAGE 分析。结果显示:不同诱导条件下表达表达量不同。利用尿素提取包涵体法提取不同条件下表达的包涵体。将包涵体分别溶于TE(Triscl-EDTA)、PBS(磷酸盐缓冲液)置于4℃冰箱中复性,然后用包涵体复性后的上清液对λDNA 进行酶切分析,结果表明:复性后的包涵体上清液中的可溶蛋白具有较强的核酸酶活性。通过对N5 基因序列分析以及将N5 同其他物种的脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因进行比对,发现N5 基因在基因水平上属于编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族成员,并找出N5 基因编码活性中心氨基酸和中心内关键氨基酸的碱基序列,通过PCR 进行对编码关键氨基酸-组氨酸的密码子分别定点突变为编码赖氨酸和丝氨酸的密码子(突变后的基因分别命名为MC578A-29、MC578B-29)。突变后,同样构建原核表达载体pET28a-MC578A-29、pET28a-MC578B-29,进行诱导表达和酶活性测定,发现突变后所编码的蛋白通过溶于PBS,4℃进行复性,复性后上清液中的可溶蛋白核酸酶活性明显下降或丧失。说明:活性中心的分析和定点突变位置的选择是正确的。对N5 和MC578A-29、MC578B-29 表达产物在不同条件进行酶活分析,证明该N5 基因编码的脱氧核糖核酸酶具有DNaseII 的特性。DNaseⅡ的作用特性:1 最佳pH 条件为酸性;2 不依赖二价阳离子;3

关键词：旋毛虫期特异性基因编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ 定点突变