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朊蛋白和苯二酚的电化学传感器研究

朊蛋白和苯二酚的电化学传感器研究

作者：李珍珍湖南大学

学位级别：硕士

朊蛋白（PrP）可导致一类致死性的神经退行性疾病,这类疾病又被称作传染性海绵状脑病（TSEs）。据研究发现,传染性海绵状脑病的产生是由于细胞型朊蛋白（PrPc）发生了构象异变,转化成了它的传染性异构体——致病型的朊蛋白（PrPsc）。... 详细信息

朊蛋白（PrP）可导致一类致死性的神经退行性疾病,这类疾病又被称作传染性海绵状脑病（TSEs）。据研究发现,传染性海绵状脑病的产生是由于细胞型朊蛋白（PrPc）发生了构象异变,转化成了它的传染性异构体——致病型的朊蛋白（PrPsc）。在病症发生前的阶段,PrPsc存在的数量还极少。因此,开发一种高灵敏度的检测方法用于朊蛋白的检测是十分重要的。另一方面,苯二酚存在三种同分异构体:对苯二酚（HQ）、邻苯二酚（CC）和间苯二酚（RC）。它们作为基本的化合物以及合成中间物被广泛应用到了多个领域。苯二酚异构体因其低降解性和高毒性被列为环境污染物质。因此,发展一种能够灵敏、快速且便捷的分析苯二酚异构体的策略是非常必要的。为了检测PrP和苯二酚异构体,我们开发了两种电化学传感器。其具体工作如下:（1）构建了一种利用二茂铁衍生物作为介体的电化学免疫传感器,用于检测朊蛋白。首先,朊蛋白一抗（Ab1）通过巯基乙酸自组装膜固定到金电极表面。之后,在金电极表面孵育牛血清白蛋白（BSA）,抑制非特异性吸附的发生。这样,PrP就能够被一抗所成功捕获。为了能将二茂铁衍生物引入传感器中,我们合成了 β-环糊精修饰的二抗复合物（CD-Ab2）。β-环糊精修饰的二抗复合物先用于结合PrP,然后以非共价结合的方式连接上二茂铁甲酸（Fc）。这种情况下,有大量的二茂铁衍生物被标记到体系中,实现了电化学信号的增强。此电化学免疫传感器对朊蛋白具有高灵敏响应,线性范围为2.5 pM到25pM,检测限达1.1 pM。（2）利用本实验组制得的中空结构碳纳米管（HCNTs）,将其修饰到玻碳（GC）电极表面来实现用电化学方法同时检测苯二酚的异构体。HCNTs能为传感器提供较高的导电性、极好的电子传递速率以及大的比表面积,以此来降低对苯二酚异构体的检测限。我们制备了 Nafion/HCNTs/GC修饰电极,并成功地用于对苯二酚异构体的同时检测。最后得到对苯二酚、邻苯二酚和间苯二酚的检测限分别为0.3μM,0.6 μM 和 0.9μM。

关键词：朊蛋白苯二酚电化学传感器二茂铁衍生物中空碳纳米管

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朊蛋白缺失对黑色素瘤的影响及其作用机制

朊蛋白缺失对黑色素瘤的影响及其作用机制

作者：甘路枫华东师范大学

学位级别：硕士

背景:既往细胞及临床研究表明,朊蛋白(Prion Protein,Pr P)与多种癌症的发生、发展、转移、耐药性及预后相关,但迄今鲜有研究用敲除动物来探究Pr P参与肿瘤生成、转移等的机制。本课题选用B16黑色素瘤细胞进行皮下及尾静脉注射,利用两... 详细信息

背景:既往细胞及临床研究表明,朊蛋白(Prion Protein,Pr P)与多种癌症的发生、发展、转移、耐药性及预后相关,但迄今鲜有研究用敲除动物来探究Pr P参与肿瘤生成、转移等的机制。本课题选用B16黑色素瘤细胞进行皮下及尾静脉注射,利用两种朊蛋白基因敲除小鼠来构建黑色素瘤原位及肺转移动物模型。方法:首先,构建黑色素瘤皮下注射原位种植模型,剂量分别为每只鼠2×10^5、1×10^5和1×10^4个B16细胞;然后,构建黑色素瘤尾静脉注射肺转移模型,剂量为每只鼠2×10^5个B16细胞,21天后观察肺部肿瘤。由于肿瘤转移与血管通透性增高密切相关,最后采用检测伊文思蓝外渗的方法,来检测血管通透性。结果:在黑色素瘤皮下注射原位种植模型中,Pr P KO型小鼠在成瘤时间、肿瘤体积及生存时间等方面都与野生型小鼠没有明显差异。而在B16尾静脉注射肺转移模型中,两种品系的Pr P敲除小鼠的肺部肿瘤数都显著多于相应的野生型(P朊蛋白过表达Tga20小鼠的肺部肿瘤数远远低于Pr P小鼠(P朊蛋白基因中的八肽重复区(octapeptide repeat,OR)的?OR KO型小鼠,其结果与Pr P全敲的Pr P KO型小鼠相似,其肺部成瘤数远多于野生型小鼠(P朊蛋白基因敲除增强了黑色素瘤肺转移,而朊蛋白过表达则抑制这一过程。八肽重复区可能是防止肿瘤转移的关键结构域。朊蛋白可能是通过影响血管通透性来影响肿瘤转移的。

关键词：朊蛋白黑色素瘤肺转移血管通透性

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朊蛋白在喉鳞状细胞癌中表达及临床意义

朊蛋白在喉鳞状细胞癌中表达及临床意义

作者：张玲石河子大学

学位级别：硕士

目的:观察朊蛋白(PrPc)在喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)中的表达情况,探讨PrPc与喉鳞癌临床病理特征的关系。方法:选取2000年6月至2013年4月收入院的喉鳞状细胞癌患者癌组织60例,喉鳞状上皮不典型增生患者病灶组织20例,非肿瘤患者的喉部正常... 详细信息

目的:观察朊蛋白(PrPc)在喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)中的表达情况,探讨PrPc与喉鳞癌临床病理特征的关系。方法:选取2000年6月至2013年4月收入院的喉鳞状细胞癌患者癌组织60例,喉鳞状上皮不典型增生患者病灶组织20例,非肿瘤患者的喉部正常粘膜组织20例。组织石蜡包埋,以每张4μm的厚度连续切片。制作组织芯片,利用由中国科学院武汉病毒研究所病毒学李朝阳实验室提供的朊蛋白4h2鼠抗人单克隆抗体作为一抗,相关试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。运用免疫组化(Envision)法检测PrPc在各组织中的表达水平,分析其与喉鳞癌患者的临床病理特征如:性别、年龄、临床分期、分型、病理分化程度、有无淋巴结转移的关系。结果:PrPc在喉鳞癌组织,喉不典型增生组织及正常粘膜组织中的表达阳性率分别为:55%(33/60),25%(5/20)及5%(1/20)。PrPc在三种组织中表达差异有统计学意义(P<0.05)。并且PrPc在喉鳞癌中的表达阳性率随其病理分化程度的降低而升高(P<0.05)。PrPc在Ⅲ+Ⅳ期肿瘤组中的阳性表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期病例组(P<0.05)。结论:PrPc在喉癌中的高表达状态很有可能参与了喉癌组织局部浸润以及远处转移的分子途径,且在肿瘤细胞发生过程中承担着重要的生理功能,PrPc的表达与TNM分期密切相关,对预测喉癌预后同样有重要临床意义。目前已经证实HPV病毒的感染与喉癌的发生发展密切相关,PrPc在喉癌细胞中的表达是否受HPV病毒感染的影响有待进一步研究,PrPc在恶性肿瘤中明显表达,其在肿瘤细胞中是否承担抗凋亡作用及广泛存在于细胞质中是否承担肿瘤细胞生长的某些功能,有待进一步研究。

关键词：朊蛋白喉肿瘤免疫组化

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朊蛋白对胃癌的诊断及预后价值研究

朊蛋白对胃癌的诊断及预后价值研究

作者：张伟华东师范大学

学位级别：硕士

研究背景：近年来的研究发现朊蛋白(prion protein,简称PrP,通常特指细胞型朊蛋白,即PrPc)在肿瘤多重耐药(Multi-Drug Resistance),肿瘤细胞浸润和黏附,肿瘤细胞的细胞周期调控等方面起着重要作用。本论文对朊蛋白在胃癌中的预后作用进... 详细信息

研究背景：近年来的研究发现朊蛋白(prion protein,简称PrP,通常特指细胞型朊蛋白,即PrPc)在肿瘤多重耐药(Multi-Drug Resistance),肿瘤细胞浸润和黏附,肿瘤细胞的细胞周期调控等方面起着重要作用。本论文对朊蛋白在胃癌中的预后作用进行研究,以给胃癌的临床诊治提供参考。研究方法：用胃癌的常规石蜡切片免疫组织化学染色和蛋白质印记法确定使用可与朊蛋白特异性结合的单克隆抗体8H4。将收集好的病例样本组织石蜡包埋后制备成组织芯片。在组织芯片上进行免疫组织化学染色及苏木素细胞核染色,染色结果评分。评分后的结果和对应的临床资料主要用SPSSv19.0进行统计分析。研究结果：朊蛋白在胃癌组织中表达量显著性低于癌旁组织(P值朊蛋白阳性患者的临床分期期数低(P值=0.012, T-test)。朊蛋白阳性的胃癌患者总生存率高(80%),而朊蛋白阴性患者总生存率相对较低(59.6%),两组之间呈现显著性差异(P值=0.028, Mantel Cox);生存曲线显示朊蛋白阴性的胃癌患者预后差：HR,2.236(95%CI:1.098,4.648)。结果讨论：朊蛋白可以作为胃癌一个预后生物标志物,胃癌组织阴性提示着预后差。

关键词：胃癌组织芯片朊蛋白预后

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抗朊蛋白单克隆抗体的免疫学特性研究

扬州大学学报（农业与生命科学版） 2009年第4期30卷 6-10页

作者：吴晓东张永强刘雨田邹艳丽刘珊李林王志亮扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009 中国动物卫生与流行病学中心-国家外来动物疫病诊断中心-国家牛海绵状脑病参考实验室山东青岛266032

以牛、羊重组朊蛋白(PrP)、正常牛、羊的脑组织匀浆、牛海绵状脑病(BSE)及羊痒病阳性的脑组织匀浆及切片为抗原,测定9株抗朊蛋白单克隆抗体的ELISA、免疫印迹及免疫组化等免疫学反应特性。结果表明:5株单抗可用于BSE及羊痒病的ELISA、... 详细信息

以牛、羊重组朊蛋白(PrP)、正常牛、羊的脑组织匀浆、牛海绵状脑病(BSE)及羊痒病阳性的脑组织匀浆及切片为抗原,测定9株抗朊蛋白单克隆抗体的ELISA、免疫印迹及免疫组化等免疫学反应特性。结果表明:5株单抗可用于BSE及羊痒病的ELISA、免疫印迹检测;3株单抗可用于BSE及羊痒病的免疫组化检测;1株单抗在免疫印迹试验中只与羊痒病PrPSc的核心片段反应,结合该株单抗所识别的抗原表位PrP第78~93氨基酸(aa),证实BSE与羊痒病PrPSc的蛋白酶K消化位点存在差异。

关键词：传染性海绵状脑病朊蛋白单克隆抗体免疫学特性

人、牛和羊叠朊基因的表达及牛叠朊蛋白抗血清的制备

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中国农业大学学报 2008年第3期13卷 14-18页

作者：刘永生唐江山路伟陈豪泰孙德惠才学鹏张杰中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部畜禽病毒学重点开放实验室兰州730046

叠朊(Dpl)是朊蛋白(PrP)的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋... 详细信息

叠朊(Dpl)是朊蛋白(PrP)的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a(+)上,将重组表达载体转入***21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS-PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在***中获得了高效表达。用Ni-NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West-blot分析表明,制备的牛Dpl抗血清与重组人、牛和羊的Dpl以及牛和羊睾丸组织的Dpl发生了特异性反应,却不与重组人、牛和羊的PrP发生反应。上述结果表明制备的Dpl抗血清可以作为人、牛和羊Dpl的检测试剂和研究材料。

关键词：传染性海绵状脑病叠朊朊蛋白基因表达抗血清

N-乙酰基转移酶10蛋白和朊蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及相关性研究

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口腔医学研究 2016年第5期32卷 483-486页

作者：郑军徐江余芯乐张杰杨洋张凯楠曾妍新疆石河子大学医学院第一附属医院口腔科新疆石河子832008 新疆石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室/医学院生化教研室

目的:检测N-乙酰基转移酶10蛋白(Naa10p)和朊蛋白(PrPc)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)、白斑、口腔正常黏膜中的表达及临床意义。方法:应用免疫组化EnvisionTM法检测OSCC(112例)、白斑(42例)及正常黏膜组织(11例)中Naa10p和PrPc的表达情况,并... 详细信息

目的:检测N-乙酰基转移酶10蛋白(Naa10p)和朊蛋白(PrPc)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)、白斑、口腔正常黏膜中的表达及临床意义。方法:应用免疫组化EnvisionTM法检测OSCC(112例)、白斑(42例)及正常黏膜组织(11例)中Naa10p和PrPc的表达情况,并分析其与临床病理特征相关性。结果:Naa10p和PrPc在OSCC表达最高,白斑次之,正常黏膜组织中表达最低。Naa10p在3种不同组织中的表达两两比较均有显著统计学差异(P<0.05),PrPc分别在白斑和OSCC组织,正常口腔黏膜与OSCC组织中的表达有统计学差异(P<0.05)。Naa10p的表达水平与OSCC的TNM分期、淋巴结转移、组织学分化程度密切相关(P<0.05),与性别、年龄无关。PrPc表达仅与组织学分化程度密切相关(P<0.05)。PrPc在OSCC中的表达强度随组织学分化程度下降而明显升高(P<0.05),而Naa10p的表达强度随组织学分化程度下降而明显下降(P<0.05)。结论:Naa10p和PrPc与OSCC的发生和转移相关。

关键词：口腔鳞状细胞癌 N-乙酰基转移酶10蛋白朊蛋白

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利用表面等离子共振技术检测牛奶中的朊蛋白

吉林农业大学学报 2010年第4期32卷 433-436页

作者：王雄万家余李吉平徐静吴松波高宏伟军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

利用生物传感器——表面等离子共振传感器建立在活体动物中检测朊蛋白的方法,依据抗原—抗体特异性原理检测牛奶中朊蛋白。结果表明:应用表面等离子共振技术进行检测,1 h以内即可达到在缓冲液中标准最低检测限30 ng/mL的水平,牛奶样品... 详细信息

利用生物传感器——表面等离子共振传感器建立在活体动物中检测朊蛋白的方法,依据抗原—抗体特异性原理检测牛奶中朊蛋白。结果表明:应用表面等离子共振技术进行检测,1 h以内即可达到在缓冲液中标准最低检测限30 ng/mL的水平,牛奶样品的最低检测限是120 ng/mL。

关键词：朊蛋白表面等离子共振牛奶

类朊蛋白Shadoo基因在Neuro-2α中的表达及细胞定位分析

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中国兽医学报 2013年第8期33卷 1223-1226页

作者：曹德康王雅静万家余李忠义孟轲音钱军武装警察部队后勤部疾病预防控制中心北京102613 武警总医院北京100700 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

为构建鼠类朊蛋白Shadoo基因重组真核表达质粒,并分析类朊蛋白Shadoo在鼠神经瘤细胞(Neuro-2α)内表达及定位。采用PCR方法把Flag标签序列插入到Shadoo阅读框122与123氨基酸位点之间,构建Shadoo-Flag融合基因片段,把Shadoo-Flag片段插... 详细信息

为构建鼠类朊蛋白Shadoo基因重组真核表达质粒,并分析类朊蛋白Shadoo在鼠神经瘤细胞(Neuro-2α)内表达及定位。采用PCR方法把Flag标签序列插入到Shadoo阅读框122与123氨基酸位点之间,构建Shadoo-Flag融合基因片段,把Shadoo-Flag片段插入到真核表达质粒pcDNA3.1,构建重组真核表达pcDNA3.1-Shadoo-Flag,质粒酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转入Neuro-2α细胞,检测Shadoo基因表达及表达部位。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-Shadoo-Flag转入Neuro-2α细胞,能够正确表达出相对分子质量为12 000的Shadoo蛋白,并定位于细胞膜。

关键词：朊蛋白 Shadoo基因鼠神经癌细胞株