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环境与职业医学 2009年第1期26卷 20-23页

作者：周贵珍曾涛张利平宋福永谢克勤丁瑾瑜(校对) 上海市嘉定区疾病预防控制中心环境疾病防治科上海201800 山东大学公共卫生学院毒理学研究所山东济南250012 潍坊医学院预防医学系山东潍坊261042 不详

[目的]研究母鸡中枢神经组织ATP含量在磷酸三邻甲苯酯(TOCP)诱导迟发性神经毒性(OPIDN)过程的变化,进一步探讨TOCP诱发OPIDN的分子机制。[方法]成年罗曼母鸡40只,随机分为d 0(正常对照组)、d 5、d 10、d 15和d 21组(每组8只),除d 0组外... 详细信息

[目的]研究母鸡中枢神经组织ATP含量在磷酸三邻甲苯酯(TOCP)诱导迟发性神经毒性(OPIDN)过程的变化,进一步探讨TOCP诱发OPIDN的分子机制。[方法]成年罗曼母鸡40只,随机分为d 0(正常对照组)、d 5、d 10、d 15和d 21组(每组8只),除d 0组外,其余各组动物一次性经口灌胃TOCP 750 mg/kg。每天观察母鸡OPIDN症状并按8级评分标准进行评价,利用高效液相色谱法(HPLC)测定母鸡大脑、小脑和脊髓组织中ATP含量。[结果]母鸡在染毒后第5天即出现间或的双腿运动轻微不协调,第21天完全瘫痪。大脑组织中ATP含量在染毒后第5天升高了20.62%(P神经组织ATP含量即出现明显的升高,提示能量的变化可能在OPIDN的发生过程中起重要作用。

关键词：磷酸三邻甲苯酯有机磷诱导的迟发性神经毒性中枢神经组织三磷酸腺苷

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PMSF对TOCP诱发OPIDN过程中母鸡神经系统内能量状态变化的影响

PMSF对TOCP诱发OPIDN过程中母鸡神经系统内能量状态变化的影响

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作者：周贵珍山东大学

学位级别：硕士

目的建立磷酸三邻甲苯酯(tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)诱导迟发性神经毒性(organophosphorus easter-induced delayed neurotoxicity，OPIDN)及受苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)保护的动物模型，利用萤光素酶生物发光法(firefly luciferase bioluminescence，FLB)测定成年罗曼母鸡中枢神经系统(central nervous system，CNS)和周围神经系统(peripheral nervous system，PNS)中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的含量，利用高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)同时测定实验动物CNS和PNS中三种腺苷酸的含量并计算相应的能荷(energy charge，EC)值。通过研究提前应用PMSF对母鸡在TOCP诱发OPIDN过程中神经系统内能量状态变化的影响，进一步探讨TOCP诱发OPIDN的分子机制。方法 1建立TOCP诱发OPIDN及受PMSF保护的的动物模型：成年罗曼母鸡80只，随机分为TOCP组(n=40)及PMSF+TOCP组(n=40)，每组又随机分为染毒后d0、d5、d10、d15和d21组(n=8)，其中TOCP组的d0组为正常对照组。PMSF+TOCP组40只动物，一次sc 60 mg／kg PMSF(溶于DMSO);20h后，两个d0组以外的其它64只实验动物，一次po 750 mg／kg TOCP。在染毒后相应的时间点处理各组动物。 2观察实验动物OPIDN症状：密切观察实验动物染毒前后一般状况的变化，每隔4d测量体重，每天观察其OPIDN症状并按8级评分标准进行评价。 3测定实验动物神经组织中ATP的含量：利用FLB检测实验动物在各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经及胫腓神经组织中的ATP含量。 4测定实验动物神经组织中三种腺苷酸的含量并计算EC值：利用HPLC检测实验动物在各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经及胫腓神经组织中的ATP、ADP及AMP含量，并计算相应的EC值以进一步反映神经组织中的能量状态。结果 1实验动物体重的变化 TOCP组动物的体重，与正常对照组相比，染毒后随着时间进展有逐渐降低的趋势，其中染毒后d21降低了23.63％(P＜0.01)。 PMSF+TOCP组动物的体重，与其d0组相比，染毒后各个时间点均有降低但不具有统计学意义，其中以染毒后d5降低的幅度最大，为4.28％(P＞0.05)。 2实验动物OPIDN症状的进展 TOCP组动物在染毒后d5出现间或的双腿运动轻微不协调，d7出现明显的双腿运动中度不协调，d9出现严重的、频发的站立和行走困难;之后OPIDN症状进展迅速，从染毒后d12开始，动物出现双腿实质性至完全性的瘫痪，d21所有动物完全瘫痪。 PMSF+TOCP组动物染毒后，与TOCP组动物相比，OPIDN症状出现明显延迟且进展相对缓慢：动物从染毒后d11开始出现间或的双腿运动轻微不协调，至d21也未出现双腿实质性的瘫痪。 3 FLB检测实验动物神经组织中ATP含量的变化 3．1大脑组织中ATP含量的变化 TOCP组动物大脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，染毒后d5、d10均有升高，其中染毒后d5升高了46.14％(P＜0.01);d15、d21分别降低了20.67％(P＜0.01)、26.57％(P＜0.01)。 PMSF+TOCP组d0组动物大脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，升高了18.09％(P＞0.05)。 PMSF+TOCP组动物大脑组织中ATP含量，与其d0组相比，染毒后d5升高了86.88％(P＜0.01);d10、d15、d21均有降低，其中d15、d21分别降低了32.40％(P＜0.01)、33.33％(P＜0.01)。 3．2小脑组织中ATP含量的变化 TOCP组动物小脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，染毒后d5、d10分别升高了86.75％(P＜0.01)、27.49％(P＜0.05)：d15、d21均有降低，其中d21降低了24.18％(P＜0.05)。 PMSF+TOCP组d0组动物小脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，升高了26.59％(P＜0.01)。 PMSF+TOCP组动物小脑组织中ATP含量，与其d0组相比，染毒后d5、d10分别升高了59.45％(P＜0.01)、24.23％(P＜0.01);d15、d21分别降低了24.03％(P＜0.01)、33.28％(P＜0.01)。 3．3脊髓组织中ATP含量的变化 TO

关键词：磷酸三邻甲苯酯苯甲基磺酰氟有机磷诱导的迟发性神经毒性三磷酸腺苷能荷值

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PMSF拮抗TOCP母鸡中枢神经组织中NFs变化及其机制

PMSF拮抗TOCP母鸡中枢神经组织中NFs变化及其机制

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作者：窦丹丹山东大学

学位级别：硕士

目的有机磷化合物(organophosphorus compounds, OPs)应用广泛,主要用作农药、增塑剂、阻燃剂、油料添加剂、润滑剂及神经毒剂等。OPs除导致急性中毒外,还会引发迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy, OPIDN)。该... 详细信息

目的有机磷化合物(organophosphorus compounds, OPs)应用广泛,主要用作农药、增塑剂、阻燃剂、油料添加剂、润滑剂及神经毒剂等。OPs除导致急性中毒外,还会引发迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy, OPIDN)。该病一般发生于急性中毒恢复后,潜伏期为2周左右,主要是以中枢神经系统中长传导束路和外周神经系统的长神经中轴突退行性变为主要特征,会导致感觉、运动的异常改变。临床上尚无特效治疗方法,主要是对症支持治疗,预后差。目前其发病机制尚不清楚,但从其超微结构上能观察到神经丝(neurofilaments, NFs)、微管等在轴突聚集和滑面内质网增生等异常改变。本实验室前期研究了磷酸三邻甲苯酯(tri-ortho-cresyl phosphate, TOCP)诱导OPIDN母鸡神经系统中NFs在21d的变化,但整个OPIDN发生发展过程中NFs如何变化尚无研究。鉴于以前研究表明,对母鸡一次性灌胃750mg/kg TOCP前24h注射60mg/kg苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)能起保护作用。本实验以此为切入点,通过建立TOCP诱导的母鸡OPIDN模型和PMSF阻断OPIDN模型观察在0,1,5,10,21d不同时间点中枢神经中NFs亚单位含量变化,研究NFs在OPIDN进程中所起的作用。并在此基础上,通过研究上述两种模型中钙激活的中性蛋白酶(Ca2+-activated neutral protease, calpain)途径和周期蛋白依赖性的蛋白激酶5 (cyclin dependent kinase 5, CDK5)介导NFs磷酸化和NFs降解的变化,揭示TOCP诱导NFs异常的原因,探讨OPIDN的发病机制,为其治疗和预防提供基础资料。方法 1. TOCP诱导母鸡OPIDN动物模型和PMSF阻断OPIDN动物模型的建立：成年罗曼母鸡适应性饲养7天后,随机分为TOCP组和PMSF+TOCP组,每组分为0d(即正常对照组)、1d、5d、10d、21d 5个时间点(n=8), PMSF按0.1 ml／kg的剂量(即60mg/kg)一次性皮下注射PMSF+TOCP组的动物,24h后,给予TOCP组和PMSF+TOCP组的实验动物一次性经口灌胃750mg/kg TOCP,正常对照组给予等体积生理盐水。密切观察实验动物染毒前后一般状况的变化,测量体重,观察其OPIDN症状并按8级评分标准进行评价(0,正常行走;1-2,间或的双腿运动轻微不协调;3-4,明显的双腿运动中度不协调;5-6,严重的、频发的站立和行走困难;7-8,双腿完全瘫痪)。在相应时间点处死各组动物,迅速取出大脑和脊髓,置于液氮中,-80℃保存。 2.中枢神经组织中NFs3种亚单位含量的测定：取母鸡大脑和脊髓组织加入预冷的匀浆缓冲液(1% Triton X-100,50mM Tris-HCl, (pH 7.5),25mM KCl,2mM MgCl2,5mM EGTA,5mM DTT, Protease Inhibitor Cocktail (0.5μl/mg protein),磷酸酶抑制剂(5mM Na3VO4, 10mM Na4P2O7和1mM碘乙酸))制备匀浆,100,000g、4℃离心60min,分离出上清和沉淀两种组份。利用SDS-PAGE和Western-blotting技术分别测定神经组织匀浆后上清和沉淀两种组份中高分子量神经丝(high molecular neurofilament, NF-H),中分子量神经丝(medium molecular neurofilament, NF-M)和低分子量神经丝(low molecular neurofilament,NF-L)3种NF蛋白的含量。 3.中枢神经组织中calpain活性测定：将大脑和脊髓组织分别剪碎后按质量体积比1：10加入匀浆缓冲液(10mM NaHCO3,5mM NaN3,15mM Tris-HCl,pH6.8),2000转／分,上下匀浆20次,10,919g、4℃离心20min,取上清150μl,加入1ml的反应缓冲液(145mM NaCl, 100mM Tris-HCl, pH 7.3),37-C水浴箱中孵育10min,再加入150μl的500gM的calpain substrateⅡ,在37℃水浴箱中振荡60min后取出1ml加入比色皿,在荧光分光光度计上用波长360nm的光线激发后,测定在440nm处发射的荧光强度。 4.中枢神经组织中CDK5含量的测定：取大脑和脊髓组织,按质量体积比1：4加入匀浆缓冲液(50mM Tris-HCl (pH7.4)

关键词：有机磷诱导的迟发性神经毒性磷酸三邻甲苯酯苯甲基磺酰氟神经丝钙激活的中性蛋白酶细胞周期依赖性蛋白激酶5

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