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食品与发酵工业 2021年第5期47卷 7-11页

作者：张亚楠申培立牛丹丹田康明 KUGEN PERMAUL SUREN SINGH 王正祥天津科技大学化工与材料学院天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457 Department of Biotechnology and Food Technology Faculty of Applied SciencesDurban University of TechnologyDurban4001South Africa

在淀粉制糖工业中,普鲁兰酶通常与糖化酶配合使用,其在酸性ph和较高温度下的催化活力是影响淀粉脱支效率的主要因素。该研究通过对长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶蛋白质解折叠自由能的差值(ΔΔG)的计算预测和突变位点稳... 详细信息

在淀粉制糖工业中,普鲁兰酶通常与糖化酶配合使用,其在酸性ph和较高温度下的催化活力是影响淀粉脱支效率的主要因素。该研究通过对长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶蛋白质解折叠自由能的差值(ΔΔG)的计算预测和突变位点稳定性分析,选择突变位点并进行定点突变,获得突变体N467G。与野生型普鲁兰酶分子相比,突变体N467G的最适作用温度提高至60℃,最适作用ph降低至4.5;其在60℃条件下孵育2.5 h或在ph 3.5~5.5孵育1 h残留酶活力均保持在80%以上,稳定性明显提高。此突变体的获得为其后续高效表达与工业化应用奠定了重要基础。

关键词：普鲁兰酶定向进化最适作用ph 最适作用温度

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普鲁兰酶N端结构域CBM68对酶学性质的影响

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南开大学学报（自然科学版） 2018年第4期51卷 93-99页

作者：曾艳郑宏臣付晓平徐健勇宋诙刘方南开大学生命科学学院天津300071 中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室天津300308 中国科学院天津工业生物技术研究所天津工业生物系统与过程重点实验室天津300308

碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules,CBMs)在普鲁兰酶结构中普遍存在,对酶的催化性质起重要作用.本文将酸性普鲁兰酶Pul B的N端结构域CBM41-X45替换成耐热普鲁兰酶Pul A的N端结构域CBM68,得到重组酶Pul-11,同时将Pul-11... 详细信息

碳水化合物结合模块(Carbohydrate Binding Modules,CBMs)在普鲁兰酶结构中普遍存在,对酶的催化性质起重要作用.本文将酸性普鲁兰酶Pul B的N端结构域CBM41-X45替换成耐热普鲁兰酶Pul A的N端结构域CBM68,得到重组酶Pul-11,同时将Pul-11的催化结构域替换成Pul A的催化结构域,得到重组酶Pul-12.结果显示,重组酶Pul-11和Pul-12的最适温度均较Pul B提高了10℃,最适ph分别提高了0.5和1;60℃下热稳定性分别提高了41.4%和44.0%;同时,重组酶Pul-11和Pul-12的底物亲和力和催化效率较Pul B也均有一定程度提高.可见,来源于耐热普鲁兰酶的新型底物结构域CBM68对普鲁兰酶的最适作用温度、最适作用ph及催化效率具有重要影响.

关键词：碳水化合物结合模块 CBM68 普鲁兰酶最适作用温度最适作用ph 催化效率

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腐乳在发酵过程中脂肪酶活力变化研究

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食品工业科技 2011年第10期32卷 261-263,272页

作者：李蓓衣杰荣上海海洋大学食品学院上海201306

研究了雅致放射毛霉脂肪酶的酶学特性及其脂肪酶活力在腐乳发酵过程中的变化,和对脂肪水解作用的程度。研究发现,雅致放射毛霉脂肪酶的最适作用温度为40℃,最适ph为7.0。对腐乳在发酵不同阶段的ph,酸值,脂肪含量以及脂肪酶活力的研究中... 详细信息

研究了雅致放射毛霉脂肪酶的酶学特性及其脂肪酶活力在腐乳发酵过程中的变化,和对脂肪水解作用的程度。研究发现,雅致放射毛霉脂肪酶的最适作用温度为40℃,最适ph为7.0。对腐乳在发酵不同阶段的ph,酸值,脂肪含量以及脂肪酶活力的研究中发现,腐乳在毛坯阶段其脂肪酶活力最高,自盐坯阶段起,脂肪酶活力一直呈下降的趋势。而脂肪含量在白坯、毛坯和盐坯(扣除盐分重量)阶段基本保持不变,在后期发酵阶段呈现下降的趋势。ph随着后期发酵的进行呈现出下降的趋势,脂肪酸值则呈现出相反的趋势,逐步上升。

关键词：雅致放射毛酶脂肪酶活力最适作用温度最适作用ph 脂肪酸值 ph 脂肪含量

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异常毕赤酵母1003胞外脂肪酶的分离纯化及表征研究

异常毕赤酵母1003胞外脂肪酶的分离纯化及表征研究

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作者：吴义真福建师范大学

学位级别：硕士

本文报道了对异常毕赤酵母(Pichia anomala Kurtzman)1003发酵培养基的优化、所产胞外脂肪酶的分离纯化及表征研究。通过培养基优化获得了适合该菌发酵和纯化的培养基配方;通过硫酸铵沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析、DEAESepharose ... 详细信息

本文报道了对异常毕赤酵母(Pichia anomala Kurtzman)1003发酵培养基的优化、所产胞外脂肪酶的分离纯化及表征研究。通过培养基优化获得了适合该菌发酵和纯化的培养基配方;通过硫酸铵沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析、DEAESepharose Fast Flow离子交换层析等方法对其发酵上清进行纯化,得到电泳纯脂肪酶。其分子量约为54.9kDa,最适作用ph为5.5,最适作用温度为45℃;该脂肪酶对链长为C4到C18的脂肪酸酯、橄榄油、大豆油、花生油均能水解,但对中短碳链(＜12C)的酯类有更好的水解效果。 1.异常毕赤酵母1003发酵培养基的优化及其脂肪酶的分离纯化通过优化获得了利于脂肪酶生产和纯化的发酵培养基配方和发酵条件:豆饼粉6.0%,NHNO0.6%,KHPO0.3%,MgSO.7HO 0.25%,橄榄油乳化液0.1%,ph 5.8,发酵36h。发酵上清通过ph4.0,40%硫酸铵饱和度的盐析得到粗分离,通过冷冻干燥进行浓缩富集,再通过Sephacryl S-100凝胶过滤层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和超滤等步骤进行纯化、浓缩,得到了电泳纯的脂肪酶,其纯化倍数及活性回收率分别为206倍、6.09%。 2.异常毕赤酵母1003纯化脂肪酶的表征研究通过SDS-PAGE估算***1003纯化脂肪酶的分子量约为54.9kDa。通过分光光度法测得其最适作用ph和温度分别为ph5.5、45℃;该酶在50℃以下、ph4.0-7.5的范围内有较好的稳定性;Ca、Mg对该酶活性起促进作用,大多数其它金属离子对该酶活性起抑制作用,Cu、Fe及金属螯合剂EDTA的抑制作用最为明显;表面活性剂Triton X-100、Tween 80及Sodium Desoxycholate对该酶有明显的促进作用,而SDS则起抑制作用;通过对其天然底物及化学合成底物的水解特异性研究得出,该脂肪酶对链长为C4到C18的脂肪酸酯、橄榄油、大豆油、花生油均能水解,但对中短碳链(＜12C)的酯类有更好的水解效果。用游离酶对该脂肪酶的转酯化能力进行初步探索,结果表明采用游离酶形式进行催化得不到转酯产物,需要进一步的实验确定其是否具有转酯化能力。 3.异常毕赤酵母1003纯化脂肪酶的质谱测序对该纯化脂肪酶电泳后进行酶解、修饰、MALDI-TOF-MS分析,测得4个肽段的氨基酸序列,分别为:对该纯化脂肪酶进行质谱分析,测定4个肽段的氨基酸序列,分别为(从左到右为-N端—C端):-V-Y-A-V-F-R-;-V-Y-Q(或K)-E-T-D-I(或L)-V-P-R-:-I(或L)-V-W-G-G-D-I(或L)-P-I(或L)-P-S-Y-S-R-;-I(或L)-Q(或K)-Y-G-E-V-T-I(或L)-I(或L)-T-Y-A-S-I(或L)-R-。由于目前国内外均未见异常毕赤酵母脂肪酶基因序列的报道,以上4个肽段氨基酸序列的获得,可为设计PCR引物,通过PCR克隆该脂肪酶基因打下基础。

关键词：异常毕赤酵母胞外脂肪酶分离纯化最适作用温度最适作用ph 质谱测序

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长野芽胞杆菌普鲁兰酶分子的定向进化

长野芽胞杆菌普鲁兰酶分子的定向进化

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作者：张亚楠天津科技大学

学位级别：硕士

普鲁兰酶可专一水解支链淀粉分支中的α-1,6糖苷键,在淀粉生物加工和生物转化中具有重要工业应用价值。本实验室在前期的研究中,已经实现了来自长野芽胞杆菌普鲁兰酶（PulA）的高产菌种的选育、高效制备和工业化生产,发酵生产处于国际... 详细信息

普鲁兰酶可专一水解支链淀粉分支中的α-1,6糖苷键,在淀粉生物加工和生物转化中具有重要工业应用价值。本实验室在前期的研究中,已经实现了来自长野芽胞杆菌普鲁兰酶（PulA）的高产菌种的选育、高效制备和工业化生产,发酵生产处于国际领先水平。但在应用于淀粉制葡萄糖工业实践中发现,其最适作用温度和最适作用ph与现有工艺使用中的糖化酶不完全匹配,增加了制糖过程的复杂性。为此,本文在分析PulA分子结构中可能影响热稳定性的相关氨基酸残基的基础上,对候选氨基酸残基位点进行定点突变和突变体的制备,并进一步系统分析突变体的酶学性质,获得如下主要结果:（1）PulA分子中多个氨基酸残基可能与其耐热耐酸性能相关。通过对PulA分子结构的分析与突变稳定性预测,共计预测到641个氨基酸残基可能对PulA的耐热耐酸性能产生影响,其中,预测有1 5个天冬酰胺残基可能与PulA的热稳定性和耐酸性有关,它们分别是:N317、N322、N342、N450、N467、N492、N521、N523、N587、N709、N734、N864、N870、N879 和 N888,分析 PulA 三级结构发现,N467、N492和N709在突变后发生了较大变化,可能对普鲁兰酶耐热耐酸性能有较大影响。（2）N467或N709突变显著影响PulA的酶学性质。分别对PulA中N467或N709位点进行了定点突变,N467突变后所形成的突变体PulA-1-1（N467G）的最适作用温度较PulA提高了5℃,最适作用ph降低了 0.5;N709突变后所形成的突变体PulA-1-3（N709R）的最适作用温度较PulA提高了5℃,其最适作用ph与PulA相比无明显改变,但其在ph 5.5和ph 6.0下的活性明显高于PulA。N492突变后所形成的PulA-1-2（N492A）的最适作用条件无明显变化。（3）N467、N492和N709组合突变显著提高PulA在更高温度和较低ph下的催化活性。进一步对N467、N492和N709位点进行组合突变获得突变体PulA-3（N467G-N492A-N709R）,其最适作用ph为4.5,在ph4.0-5.0之间酶活保持在90%以上;最适作用温度为60℃,在50-60℃范围内酶活保持在90%以上;在ph 4.5和60℃下的催化活力较PulA提高约20%。

关键词：普鲁兰酶定向进化最适作用ph 最适作用温度比酶活

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