检索结果-南通市图书馆

作者：王淼淼江南大学

学位级别：硕士

蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,简称SPase)作为一种葡萄糖基转移酶,能够以蔗糖为供体、葡萄糖为受体,通过转苷反应制备曲二糖。曲二糖具有促进肠道益生菌生长、抑制α-葡萄糖苷酶活性及延缓碳水化合物消化吸收等功能,在食品和医... 详细信息

蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,简称SPase)作为一种葡萄糖基转移酶,能够以蔗糖为供体、葡萄糖为受体,通过转苷反应制备曲二糖。曲二糖具有促进肠道益生菌生长、抑制α-葡萄糖苷酶活性及延缓碳水化合物消化吸收等功能,在食品和医药领域具有广泛应用潜力,通常采取SPase等合成曲二糖。然而,目前报道的SPase仅在大肠杆菌中异源表达,并不适用于食品工业应用,而枯草芽孢杆菌(***)作为食品安全宿主则是表达SPase的更佳选择。本研究首次将青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)来源的蔗糖磷酸化酶在*** WS11中异源表达,研究了SPase作为一种天然胞内酶却被分泌至胞外的原因,并对其酶学性质进行研究。在此基础上,优化重组酶制备曲二糖的工艺。此外,采用多种固定化载体对SPase进行固定化,获得了较好的固定化效果。主要研究结果如下:(1)构建重组菌***/pBSMuL3-SPase和***/pHY300PLK-SPase,其中重组菌***/pBSMuL3-SPase摇瓶发酵酶活更高,胞内酶活为0.56 U·mL。此外,还意外发现其胞外酶活高达1.58 U·mL,此胞外表达现象简化了酶液获取过程。进一步分析SPase高效分泌至胞外的原因,推测SPase是通过非典型分泌途径被分泌到胞外。(2)将酶液进行纯化,考察其酶学性质。结果表明重组酶的最适反应pH为7.5,最适温度为60℃,在60℃和55℃的半衰期分别为20 h和80 h,且有广泛的pH耐受性。(3)利用重组SPase催化合成曲二糖,在单因素优化的基础上,进行L9(3)正交试验。最终得到最佳工艺条件:加酶量为20 U·g,蔗糖/葡萄糖为0.5 M/0.5 M,pH 7.0,反应温度50℃,反应时间36 h,在此条件下生成曲二糖的转化率为40.01%,产量为104.45g·L,纯度为44.16%。为得到更高纯度的曲二糖,采用酿酒酵母处理产物除去可消化糖,最终得到纯度为95.14%的曲二糖。(4)采用壳聚糖-聚乙二醇、LX-1000EA、LX-1000HA三种载体对重组SPase进行固定化,其中LX-1000HA固定化SPase操作方便,固定化和应用效果好、成本低。在加酶量9 U·g、固定化时间为16 h时,LX-1000HA固定化SPase酶活回收率达到101.82%。酶学性质表明,其最适温度为55℃,最适pH为7.0。利用LX-1000HA固定化SPase连续反应8批次后,残留酶活为97.03%,且转化率仍保持在45.24%。上述实验结果表明,该固定化酶可有效促进曲二糖的合成,且具有良好的操作稳定性,从而为固化酶工业化连续生产曲二糖提供参考价值。

关键词：蔗糖磷酸化酶曲二糖固定化枯草芽孢杆菌

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青春双歧杆菌蔗糖磷酸化酶诱导表达条件的优化及其酶学性质

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食品研究与开发 2024年第23期45卷 194-202页

作者：朱乐婷宋文军娄婷婷吴子健张宏宇王丹芸张得光王亦心董淑元天津商业大学生物技术与食品科学学院天津市食品生物技术重点实验室天津300134 天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津300457

蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase,SPase)不仅能够水解蔗糖产生α-葡萄糖-1-磷酸,还能对多种底物进行糖基化修饰。来源于青春双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium adolescentis sucrose phosphorylase,Ba SP)的双突变体L341I_Q345S(Ba SP-IS)对曲二糖的合成具有高选择性。为进一步挖掘Ba SP-IS合成曲二糖的潜力,该文将Ba SP-IS在大肠杆菌中异源表达,以水解活性为指标,通过单因素试验和响应面法对其诱导表达条件进行优化,并对其转糖基化活性及酶学性质进行研究。结果表明,Ba SP-IS的最佳表达条件为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)浓度0.4 mmol/L、诱导时间17 h、诱导温度25℃,在此条件下,粗酶液的水解活性达到11.88 U/mL。酶学性质研究结果表明,Ba SP-IS在合成曲二糖时的最适反应温度为55℃、最适反应pH值为7.0,动力学参数K_(m)值为(145.749 78±7.897 30)mmol/L,最大反应速率V_(max)值为(0.091 57±0.001 72)mmol/(L·min)。

关键词：蔗糖磷酸化酶曲二糖大肠杆菌异源表达酶学性质

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