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Streptomyces canus氨肽酶的表达、酶学性质及其在大米肽制备中的应用

Streptomyces canus氨肽酶的表达、酶学性质及其在大米肽制备中的...

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作者：秦琴江南大学

学位级别：硕士

大米蛋白是营养价值高的膳食蛋白,但其低溶解性和高度变性限制了大米蛋白资源的开发。而大米肽除了保留大米蛋白原有的优良性质外,还具备调节人体免疫、缓解衰老、改善肠道菌群稳态等功效,被公认为优质食源性肽。目前,优质大米肽主要由... 详细信息

大米蛋白是营养价值高的膳食蛋白,但其低溶解性和高度变性限制了大米蛋白资源的开发。而大米肽除了保留大米蛋白原有的优良性质外,还具备调节人体免疫、缓解衰老、改善肠道菌群稳态等功效,被公认为优质食源性肽。目前,优质大米肽主要由蛋白酶与氨肽酶协同水解大米蛋白制备而成,即蛋白酶水解大米蛋白释放肽,随后氨肽酶去除肽N端引发苦味的疏水性氨基酸。目前,大米肽酶法制备的研究多集中在蛋白酶,有关脱苦的氨肽酶鲜有报道,以至于现有的氨肽酶对大米肽的脱苦效果并不显著。故亟需获得对大米肽脱苦效果显著的氨肽酶,并考察其与蛋白酶复配在大米肽制备中发挥的作用。本课题从实验室保藏的胞外有高氨肽酶酶活的天然菌株t20中获得氨肽酶ScAP,将其在食品级宿主菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中异源表达后进行酶学性质表征与序列结构分析。同时考察氨肽酶ScAP对大米肽的脱苦效果,随后氨肽酶ScAP与胰蛋白酶复配水解大米蛋白,并优化制备条件获得优质大米肽。主要研究成果如下:(1)完成菌株t20种属分析、产氨肽酶条件优化及酶的鉴定。鉴定了野生菌t20,其所属种为暗灰链霉菌(Streptomyces canus)。以不同蛋白/肽为唯一营养源诱导*** t20产氨肽酶,其中大米蛋白的诱导效果最佳,2%大米蛋白诱导发酵4 d后胞外氨肽酶酶活最高,达310.90 U·m L。从发酵液中分离的潜在氨肽酶经肽指纹图谱分析,与Streptomyces fulvoviolaceus来源氨肽酶(WP＿043454179.1)相似度最高,将其命名为氨肽酶ScAP。(2)完成*** t20氨肽酶ScAP克隆表达、酶学定性及序列结构分析。从*** t20基因组PCR扩增出目标基因scap,并在***中重组表达,重组菌发酵24 h后胞内氨肽酶ScAP酶活达271.03 U·m L。纯化的氨肽酶ScAP比活高达6216.67 U·mg,为文献报道链霉菌来源氨肽酶最高水平。氨肽酶ScAP最适温度为60℃,最适p H为8.0,在50℃半衰期为285 h,在p H 9.0半衰期为48 h。Ca和Co对酶有激活作用,在0.1 mmol·L浓度下,相比对照酶活分别增加至115.44%和104.03%。0.1 mmol·L EDtA可使其完全失活,重新添加Co、Zn和Mn可部分地恢复去除Zn的氨肽酶ScAP酶活。氨肽酶ScAP对N端的Leu、Met和Phe等疏水性氨基酸表现出高水解偏好性,ScAP的结构分析表明其底物结合区域表现出更高的疏水性。(3)验证氨肽酶ScAP制备高品质大米肽的能力。以大米肽为底物进行氨肽酶ScAP脱苦效果的评估,大米肽经氨肽酶ScAP(终浓度0.48 mg·m L)处理2 h,苦味下降50.68%,游离疏水氨基酸含量增加80倍,表明氨肽酶ScAP能够有效去除大米肽N端疏水氨基酸,进而有效降低肽的苦味。随后,氨肽酶ScAP与胰蛋白酶复配制备大米肽。经优化,最佳制备条件为:胰蛋白酶和氨肽酶ScAP分别以1:5和3.33%加酶量(w·w)在50℃以一步水解法酶解大米蛋白4 h。相比胰蛋白酶单独水解,双酶复配产物中小分子肽(180-1000 Da)含量提高了145.00%,达4.41 mg·m L,苦味下降15.76%。随后对制备的大米肽进行生物活性评价,其自由基清除能力、还原能力和血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性对比商品大米肽或商品氨肽酶参与制得大米肽具有整体优势。

关键词：暗灰链霉菌t20 氨肽酶大米肽脱苦生物活性

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