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番茄水杨酸受体NPR1的表达、纯化和晶体筛选

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番茄水杨酸受体NPR1的表达、纯化和晶体筛选

作者：屈闪闪河南大学

学位级别：硕士

病原体、微生物等对植物的生长具有巨大的影响,植物在长期进化的过程中具备了免疫能力,形成了能够针对外源性入侵的免疫系统。通常分为两类,一类是在细胞外表面,由微生物相关分子模式和损伤相关分子模式引起的模式识别受体触发性免疫;... 详细信息

病原体、微生物等对植物的生长具有巨大的影响,植物在长期进化的过程中具备了免疫能力,形成了能够针对外源性入侵的免疫系统。通常分为两类,一类是在细胞外表面,由微生物相关分子模式和损伤相关分子模式引起的模式识别受体触发性免疫;另一类是在细胞内,由病原体释放的毒性效应因子引起的效应因子触发性免疫。在两种免疫系统中重要的激素就是水杨酸。水杨酸主要是通过它的受体NPR1、NPR3/NPR4感知,进而发挥作用,而且NPR1是一种高亲和力的水杨酸结合蛋白,其结合活性是水杨酸诱导的免疫反应中所必需的。水杨酸不同受体的进化和维持很可能是由于需要对水杨酸应答进行复杂的控制。当水杨酸水平低时,NPR3/NPR4抑制防御基因表达,其防止自身免疫。增加的水杨酸消除阻遏作用,并允许通过转录共激活因子NPR1进一步诱导防御基因表达。但是NPR1如何调控转录因子、与转录因子结合调控下游基因的表达,并与水杨酸结合的机制目前并不是特别清楚。本论文希望通过解析NPR1的结构来解释其调控机制,并希望进一步阐述水杨酸的感知及信号调控的具体机制。本论文研究的是番茄NPR1蛋白,蛋白表达时,主要采取两种表达方式:原核表达和真核表达。原核表达中,构建NPR1::pET-28a的蛋白表达载体,低温低速诱导产生蛋白,采用此表达方式,蛋白纯化后筛选并不能得到晶体。采用以下优化条件:提高缓冲液的pH值,增加溶解蛋白的能力;洗脱杂蛋白的咪唑浓度分别提高到50 mM和70 mM;采用离子交换保证蛋白所带电荷的性质、分布和强度;采用凝胶过滤层析确保蛋白聚合状态的均一性;最终即使经过各种条件优化,在原核表达中并不能筛选出质量合格的蛋白晶体。利用对蛋白具有修饰作用的Bac-to-Bac真核表达蛋白系统,通过sf-9细胞进行NPR1蛋白的稳定表达,构建NPR1::pFastBac1真核表达载体,将载体包装成病毒模式即杆粒通过病毒感染细胞的方式产生目的蛋白。用贴壁细胞来验证目的蛋白并扩大病毒数量,利用大量的悬浮细胞稳定表达目的蛋白,将细胞裂解后纯化胞内释放的蛋白,经过离子交换、凝胶过滤层析并再次的晶体筛选,十种筛选试剂盒中,最终在PEG/lon晶体筛选条件下看到了晶体形态,并用亚甲基蓝染色初步鉴定。本论文主要采用两种蛋白表达方式,并在每种表达技术中实施蛋白条件的优化,根据前期结果制定相对应的优化策咯,以得到比较纯且质量较高的蛋白,使用晶体筛选试剂盒的多次晶体筛选,目前所采用的表达技术得到的蛋白生长出了蛋白晶体。希望能够为后续的结构解析奠定基础,通过对目的蛋白的结构有深入的了解,以期望在结构方面上提出解决问题的新思路,对后来功能的解析有所帮助。

关键词：番茄 NPR1 原核表达真核表达晶体筛选

拟南芥新型赤霉素合酶的表达、纯化及晶体筛选

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拟南芥新型赤霉素合酶的表达、纯化及晶体筛选

作者：赵婕河南大学

学位级别：硕士

赤霉素(Gibberellin acid,GA)是一种四环双萜类的植物激素,在植物发育过程中起有重要作用。在自然界中存在130多种赤霉素,但在植物体内,仅有少数的赤霉素分子是具有活性的,如已知的GA、GA、GA以及GA等。这些具有活性的赤霉素分子调控植... 详细信息

赤霉素(Gibberellin acid,GA)是一种四环双萜类的植物激素,在植物发育过程中起有重要作用。在自然界中存在130多种赤霉素,但在植物体内,仅有少数的赤霉素分子是具有活性的,如已知的GA、GA、GA以及GA等。这些具有活性的赤霉素分子调控植物生长以及发育的各个阶段,主要体现在促进种子萌发、促进主根的伸长、促进叶片的舒展和促进花分生组织的建立等方面。GA和ABA是植物体内尤为重要的两种激素,共同调控植物种子萌发。GA促进种子萌发、植物开花以及果实的成熟等。相反,ABA则在种子萌发过程中起抑制作用。GAS1(gain function of ABA insensitive 1)是本实验室前期筛选得到的一株对ABA不敏感的突变体,研究表明GAS1超表达植株的种子萌发表现出ABA的抗性,而缺失突变体表现出种子萌发迟缓的表型。进一步研究发现该突变基因编码一个氧化还原酶GAS1,它可以将GA催化为一种全新的GA分子,我们将其命名为GA,而催化GA生成全新GA的反应机制并不清楚。根据前期研究结果分析,并没有关于GA合成相关氧化还原酶的结构被解析,那么GA是否与其它GA一样具有生物活性也不清楚。因此,我们拟通过对GAS1蛋白进行表达纯化和晶体结构解析来了解GAS1是如何行使生物学功能的。本课题利用多种原核表达载体进行蛋白表达,使蛋白带有不同的标签,但由于带有GST标签的蛋白表达量过低,因此本文中主要表达带有His标签的蛋白进行进一步的纯化。通过适当时间的菌株活化并进行细胞生长曲线的测定,在OD值为0.6-0.8左右收集菌株为最佳状态。之后采用高压破碎,超声波破碎,Ni柱亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤层析等纯化方法来优化GAS1蛋白。Western Blot实验来检测蛋白的正确表达。利用10种晶体筛选试剂盒,共480种池液条件对GAS1蛋白的结晶情况进行初步筛选,但全长的GAS1蛋白在480种晶体筛选试剂中都未能有蛋白晶体的析出。为了进一步增加蛋白的稳定性,利用底物GA处理目的蛋白,形成共结晶的状态,但可能尝试的底物浓度并不合适,只得到了类似赤霉素的晶体,进一步实验中设定了不同浓度梯度的底物对蛋白进行处理,试图找到了最适晶体生长的底物浓度,但长出的晶体并非是蛋白晶体,而是盐晶晶体。根据离子交换层析和凝胶过滤层析的蛋白吸收峰显示的结果和SDS-PAGE凝胶的结果进行分析,推测是由于蛋白质的不均一性造成结晶困难,而这种情况极有可能是由于蛋白降解所造成的。所以结合生物信息学软件分析结果与N端测序的结果对全长序列进行分析后,决定构建GAS1蛋白截短克隆GAS1ΔN62和GAS1ΔN56,使用的原核表达载体仍为pET-28a菌株。在得到重组克隆菌株以后,对GAS1ΔN62进行表达、纯化和优化,以及晶体的筛选。同时,为了证明GAS1蛋白在整个赤霉素信号转导过程中是具有活性的,且能够在其转导途径中表现出生物学功能,使用分子对接软件Auto Dock进行蛋白质与化合物之间的互作预测,发现GAS1可以与GA相互作用,从而得到了一些相互作用位点,这些氨基酸,极有可能在两者之间行使识别与催化的功能。同时,为了证明生成的GA像其它的GA一样具有生物学活性,进一步模拟了GA与赤霉素受体GID1A之间的相互作用,发现两者也存在一些作用位点,这些位点表明GA可以与GID1A进行识别并特异性的结合,从而行使生物学功能。

关键词：赤霉素 GAS1蛋白蛋白纯化晶体筛选结构预测

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超抗原SPE-G蛋白的表达纯化及晶体筛选

武汉轻工大学学报 2018年第1期37卷 11-15页

作者：刘昭鑫曾驰武汉轻工大学生物与制药工程学院湖北武汉430023

超抗原是一种主要由金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌产生的蛋白毒素,其与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子和T细胞受体结合,在极低浓度下即可非特异地激活大量T细胞,产生极强免疫应答效应。链球菌致热外毒素G(SPE-G)是典型超抗原之一,但迄今尚... 详细信息

超抗原是一种主要由金黄色葡萄球菌和酿脓链球菌产生的蛋白毒素,其与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子和T细胞受体结合,在极低浓度下即可非特异地激活大量T细胞,产生极强免疫应答效应。链球菌致热外毒素G(SPE-G)是典型超抗原之一,但迄今尚无对SPE-G的结构生物学研究。通过原核表达、纯化得到高纯度SPE-G蛋白,利用坐滴法对蛋白结晶条件进行筛选,最终获得了性状较好的SPE-G晶体,为SPE-G蛋白结构解析及更深入的研究奠定了基础。

关键词：超抗原 SPE-G 晶体筛选

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铜绿假单胞菌寡核苷酸酶的纯化、结晶和活性验证

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吉林大学学报（医学版） 2022年第5期48卷 1124-1130页

作者：张建羽张琼林南开大学生命科学学院生物化学与分子生物学系天津300071

目的:研究致病菌铜绿假单胞菌寡核苷酸酶(PaOrn)的三维结构和体外水解活性,验证PaOrn活性位点并探讨PaOrn对铜绿假单胞菌(***)胞内3',5'-环二鸟苷(c-di-GMP)水平和致病毒性的影响。方法:构建重组质粒pET 32M3C-PaOrn,在大肠杆菌(***)BL2... 详细信息

目的:研究致病菌铜绿假单胞菌寡核苷酸酶(PaOrn)的三维结构和体外水解活性,验证PaOrn活性位点并探讨PaOrn对铜绿假单胞菌(***)胞内3',5'-环二鸟苷(c-di-GMP)水平和致病毒性的影响。方法:构建重组质粒pET 32M3C-PaOrn,在大肠杆菌(***)BL21中诱导表达目的蛋白,获得组氨酸(His)标签和谷胱甘肽(GST)标签标记。采用多级纯化方法纯化蛋白,经Ni亲和层析、GST亲和层析和阴离子交换层析后获得高纯度和高均一性PaOrn目的蛋白。采用商业化结晶试剂和坐滴法筛选晶体,根据晶体状态进一步优化。采用X射线衍射法验证晶体质量,分辨率高于3Å时用于结构解析。采用高分辨质谱技术Q TOF验证PaOrn蛋白水解底物二鸟苷磷酸(pGpG)活性,鸟苷单磷酸(GMP)产物作为验证活性的指标。采用尿素聚丙烯酰胺(Urea-PAGE)法验证PaOrn蛋白和点突变PaOrn蛋白(Orn^(D11A)、Orn^(E13A)、Orn^(D111A)、Orn^(H157A)和Orn^(D162A))对10 nt长度寡核苷酸RNA的水解活性,降解条带作为活性正常的分析指标。结果:经原核系统表达和多级纯化,得到纯度高达95%的目的蛋白PaOrn。于结晶试剂WizardⅠ#12[1.0 mmol·L^(-1)(NH4)2HPO4,0.1 mmol·L^(-1) Imidazole]pH 8.0条件下生长出质量较好的单晶,晶体PaOrn的分辨率为1.85Å,复合物PaOrn-GMP和PaOrnD11A-pGpG的分辨率分别为1.90Å和1.70Å。高分辨质谱,PaOrn将底物pGpG水解为GMP。尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳,PaOrn可降解长达10 nt的RNA,当活性位点Asp11、Glu13、Asp111、His157和Asp162分别突变后,PaOrn丧失活性,无法降解底物pGpG和RNA(10 nt)。结论:PaOrn通过降解寡核苷酸参与调控胞内c-di-GMP和RNA水平,影响转录起始和细胞多种生物学行为。

关键词：铜绿假单胞菌寡核苷酸酶 3’ 5’-环二鸟苷蛋白纯化晶体筛选

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火球菌RecJ蛋白的表达纯化及结晶

核技术 2013年第8期36卷 15-19页

作者：杨敏李敏军周欢陈亚星孙丽华郁峰徐春艳唐琳何建华中国科学院上海应用物理研究所张江园区上海201204

RecJ蛋白是一类在细菌和古菌中高度保守的蛋白,在细胞内参与同源重组、甲基指导的碱基错配修复和碱基切除修复等过程。RecJ蛋白除了可以从单链DNA的5端降解DNA外,还可以从单链RNA的3端降解RNA。为能够从结构上阐明古菌火球菌(Pyrococcus... 详细信息

RecJ蛋白是一类在细菌和古菌中高度保守的蛋白,在细胞内参与同源重组、甲基指导的碱基错配修复和碱基切除修复等过程。RecJ蛋白除了可以从单链DNA的5端降解DNA外,还可以从单链RNA的3端降解RNA。为能够从结构上阐明古菌火球菌(Pyrococcus furiosus)RecJ蛋白在细胞内的功能和其对不同底物(RNA/DNA)的降解活性的影响,本实验采用蛋白质晶体学的方法,通过蛋白质的表达纯化,晶体筛选得到了火球菌RecJ蛋白的晶体,并通过结晶条件的初步优化得到了有衍射的晶体。

关键词： RecJ蛋白蛋白质表达纯化晶体筛选 X射线衍射

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牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277菌株外切聚磷酸酶的表达、纯化和结晶

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科学技术与工程 2020年第3期20卷 950-955页

作者：张爱莉卢作焜李蓉芳李文文许昌学院食品与生物工程学院河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室许昌461000

外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase,PPX)对于细菌在恶劣环境下引起的严紧反应、病原菌的致病性和抗生素耐药性等生物学过程必不可少。牙龈卟啉单胞菌是与牙周炎关系最密切的病原菌。为解析牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC ... 详细信息

外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase,PPX)对于细菌在恶劣环境下引起的严紧反应、病原菌的致病性和抗生素耐药性等生物学过程必不可少。牙龈卟啉单胞菌是与牙周炎关系最密切的病原菌。为解析牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277菌株的外切聚磷酸酶(PgPPX)的结构,首先利用大肠杆菌对PgPPX蛋白基因进行克隆与蛋白表达,然后依靠谷胱甘肽巯基转移酶标签对融合蛋白亲和层析后,采用阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱得到表面电荷、聚合形态均一的PgPPX蛋白,最后对纯化后的目的蛋白进行结晶条件筛选。结果表明:PgPPX蛋白在溶液中表现为二聚体形式,纯度大于98%,表达量高达30 mg/L,且该蛋白在0.2 mol/L MgSO 4·6 H 2O、20%PEG3350(m/V)条件下获得的晶体形状较好。

关键词：外切聚磷酸酶牙龈卟啉单胞菌高效表达纯化晶体筛选

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牙龈卟啉单胞菌TDC60菌株唾液酸酶的表达、纯化和结晶

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牙龈卟啉单胞菌TDC60菌株唾液酸酶的表达、纯化和结晶

作者：董文博安徽医科大学

学位级别：硕士

牙周病是世界上最常见的口腔疾病。作为人类口腔微生物组成的一部分,牙龈卟啉单胞菌属于革兰氏阴性厌氧杆菌(Porphyromonas gingivalis,***),它在牙周病的发生和发展中有着非常重要的作用。唾液酸酶是牙龈卟啉单胞菌的毒力因子之一。现... 详细信息

牙周病是世界上最常见的口腔疾病。作为人类口腔微生物组成的一部分,牙龈卟啉单胞菌属于革兰氏阴性厌氧杆菌(Porphyromonas gingivalis,***),它在牙周病的发生和发展中有着非常重要的作用。唾液酸酶是牙龈卟啉单胞菌的毒力因子之一。现有的研究表明,牙龈卟啉单胞菌唾液酸酶(***)可以修饰宿主细胞表面的糖缀合物,从而暴露细菌识别的潜在结合位点。***催化后的去唾液酸化的蛋白可以被蛋白酶进一步水解,生成牙龈卟啉单胞菌细菌分解特性所需的肽。鉴于***对病原体-宿主相互作用和毒力的重要性,***有足够的潜力成为牙周病的治疗靶点。然而,缺乏蛋白结构信息阻碍了***的进一步研究和抑制剂设计。为了得到牙龈卟啉单胞菌唾液酸酶蛋白的结构,探索其功能,本实验利用全基因合成牙龈卟啉单胞菌TDC60菌株的唾液酸酶基因,利用分子克隆技术成功构建了牙龈卟啉单胞菌唾液酸酶-p ET28a的重组表达载体。对重组表达载体经过大肠埃希杆菌系统的外源性表达和筛选、镍柱离子亲和层析、凝胶过滤层析的纯化和优化后,得到了足量、均一、稳定的目的蛋白用于蛋白质结晶实验。使用蛋白结晶试剂盒对蛋白晶体的生长进行初筛和优化后,我们在4个高盐条件下找到了体积较大、较为完整、形态良好的针状晶体。最后在0.1 M Tris-HCl p H 7.0?1.4 M酒石酸二铵条件下收集到的X射线衍射数据分辨率为2.1?,然后进行了蛋白三维结构的解析和氨基酸的搭建,揭示了典型的碳水化合物结构域和催化结构域。后将产物唾液酸模拟到活性位点口袋中,并结合动力学分析,使我们能够清楚地识别底物结合和催化所需的关键残基。此外,与其他唾液酸酶的结构比较揭示了活性位点口袋的不同特征,这可能赋予底物结合的特异性。这些发现为进一步设计和优化靶向抑制剂以对抗牙龈卟啉单胞菌衍生的口腔疾病提供了结构基础。

关键词：唾液酸酶牙龈卟啉单胞菌晶体筛选 X线衍射牙周疾病

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致龋性变形链球菌蛋白的初级晶体学研究

致龋性变形链球菌蛋白的初级晶体学研究

作者：展秀荣兰州大学

学位级别：硕士

目的：龋病是口腔的常见病多发病,并已经成为严重危害人类健康及生活质量的疾病。目前,我国的龋病处于高发状态,迫切需要寻求有效的防龋方法来提高口腔健康防治水平。变形链球菌是人类龋病的主要致病菌,通过对变形链球菌进行结构基因组... 详细信息

目的：龋病是口腔的常见病多发病,并已经成为严重危害人类健康及生活质量的疾病。目前,我国的龋病处于高发状态,迫切需要寻求有效的防龋方法来提高口腔健康防治水平。变形链球菌是人类龋病的主要致病菌,通过对变形链球菌进行结构基因组学方面的研究,更好地理解该菌基因的复杂性和特异性,其如何摄取营养、抵抗宿主防御以适应口腔环境,为新的防治龋病措施的发现和新药物的开发奠定基础。方法：蛋白质晶体学是结构基因组学的主要研究手段,可用于解析蛋白质三维结构及基于结构的药物设计方面的研究。本实验利用北京大学结构生物学实验室高通量结构基因组学实验平台,通过靶基因筛选、高通量自动化基因克隆和表达、高通量蛋白纯化、晶体筛选、晶体衍射数据收集和晶体结构解析的一整套实验流程进行致龋性变形链球菌蛋白的结构基因组学研究。结果：本论文的主要工作是对变形链球菌基因组中的两个基因：SMU.2055、SMU.1254进行了蛋白纯化和晶体筛选工作。目的基因被克隆并连入pET28a载体中,SMU.2055、SMU.1254在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达、可溶性良好并获得了可溶性较高的蛋白。用金属镍螯合层析和凝胶排阻层析对蛋白进行纯化得到较为均一的目的蛋白,再以坐滴蒸汽扩散法初筛得到目的蛋白的晶体,并通过进一步的优化得到适合上机衍射和数据收集的晶体。其中,SMU.2055的蛋白晶体和其硒代甲硫氨酸蛋白晶体的衍射数据已经被收集,蛋白结构已解析(PDB：3LD2)。SMU.1254的蛋白晶体及其泡重原子晶体衍生物的衍射数据已经被收集,蛋白结构还在解析之中。结论：致龋性变形链球菌SMU.2055、SMU.1254蛋白的结构基因组学及蛋白质晶体学的研究,原子水平上深入了解变形链球菌中蛋白的结构和功能,为更好的研究变形链球菌蛋白在生物体内代谢及龋病发生、发展进程中的生物学功能作用奠定了基础。

关键词：龋病变形链球菌蛋白质晶体学结构基因组学蛋白纯化晶体筛选

猪轮状病毒VP3蛋白C端结构域的结构学研究

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猪轮状病毒VP3蛋白C端结构域的结构学研究

作者：张慧敏华中农业大学

学位级别：硕士

轮状病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜共患病原之一,腹泻和呕吐为其主要引起的典型临床症状。轮状病毒的存在,不仅严重影响畜牧业的发展,同时也威胁到人类的安全,引起严重经济损失,成为科学研究的焦点。本研究将以猪轮状病毒(Procine Rot... 详细信息

轮状病毒(Rotavirus,RV)是重要的人畜共患病原之一,腹泻和呕吐为其主要引起的典型临床症状。轮状病毒的存在,不仅严重影响畜牧业的发展,同时也威胁到人类的安全,引起严重经济损失,成为科学研究的焦点。本研究将以猪轮状病毒(Procine Rotavirus,PRV)结构蛋白VP3的C端结构域(VP3-CTD)作为主要研究对象,通过结构生物学方法分析其在病毒致病性和免疫逃逸方面的作用。研究表明人源VP3-CTD对RV的致病性有重要影响。同时,该区域还具有2’,5’-磷酸二酯酶(2’-5’PDEs)的活性,可以通过切割由2’,5’-寡腺苷酸合成酶(2’,5’-oligoadenylate synthetase,OAS)合成的2’,5’-寡腺苷酸(2’-5’A)来抑制OAS-RNase L信号通路,使病毒逃逸宿主的先天性免疫致使机体发病。因此,通过研究PRV VP3-CTD的结构,可以进一步了解PRV的致病和免疫逃逸的机制,为抗PRV的药物的筛选奠定基础。本研究首先对猪轮状病毒VP3-CTD基因密码子进行优化,并将VP3-CTD基因克隆到原核表达载体p ET30a上进行原核表达纯化;在原核表达过程中对含有重组载体的Rosseta(DE3)表达条件进行优化,结果表明在0.5mmol/L IPTG、18℃、180rpm/min、18h的条件下目的蛋白的可溶性良好,获得了可溶性较高的蛋白;将表达的蛋白利用Ni2+柱亲和层析和分子筛层析进行纯化,并通过超滤法得到了高浓度、高纯度、非单体形式的VP3-CTD蛋白进行后续的蛋白结晶实验的蛋白结晶实验。在蛋白结晶条件筛选方面,本研究采用坐滴法进行筛选。通过多种条件的筛选,我们发现在HR2-110试剂盒的36号条件下(0.1mo/L Tris-HCl p H 8.5,8%PEG8000)蛋白结晶状况较好,最终通过进一步的优化得到晶体生长的最佳条件为0.15mol/L Tris-HCl p H 8.3、4%PEG8000、8%EG、60 days、20℃;在该条件下蛋白可以结晶成X射线衍射较强的规则长方体晶体,其晶体大小为15μm×15μm×200μm,通过X射线衍射实验得到晶体的分辨率为2.3?,并收取数据。利用分子置换法和多种晶体分析软件进行数据分析,解析出VP3-CTD的蛋白晶体结构。通过分析表明VP3-CTD是以同源二聚体的形式存在,其单体结构主要有2个α螺旋和7个β折叠组成,C端的β折叠形成一个凹槽,该蛋白的表面静电势显示,凹槽主要带正电荷,二聚体是两分子VP3-CTD蛋白的凹槽互补嵌合的结构,中间形成一个带较强正电荷的间隙,推测其为结合和切割带负电荷的2’-5’A的区域。总之,本研究通过表达和纯化PRV的VP3-CTD蛋白,并对其进行晶体结构的解析,进一步揭示了其切割2’-5’A的结构基础,为抗PRV药物的筛选提供理论依据。

关键词：猪轮状病毒 VP3-CTD蛋白蛋白表达和纯化晶体筛选蛋白结构解析