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成纤维细胞生长因子1型受体-显性失活作用对骨诱导培养骨髓基质干细胞矿化的影响

中华创伤骨科杂志 2017年第9期19卷 801-805页

作者：李霞徐文漭简洪李福兵徐永清解放军昆明总医院骨科全军创伤骨科研究所650032 解放军昆明总医院病理科 650032

目的探讨成纤维细胞生长因子1型受体．显性失活作用（FGFRlDN）对骨诱导培养骨髓基质干细胞（BMSCs）成骨矿化的影响。方法取第3代BMSCs转染，根据细胞转染方法不同分为4组（n=24）：FGFRl-DN组[采用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-FGFRlD... 详细信息

目的探讨成纤维细胞生长因子1型受体．显性失活作用（FGFRlDN）对骨诱导培养骨髓基质干细胞（BMSCs）成骨矿化的影响。方法取第3代BMSCs转染，根据细胞转染方法不同分为4组（n=24）：FGFRl-DN组[采用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-FGFRlDN转染]、FGFRl组【采用pcDNA3．1（＋）．FRFRl转染】、空载体转染组和未转染组。证实转染成功后，待细胞处于对数生长期时进行成骨诱导培养，连续培养21d，观察矿化结节形成情况并行茜素红染色，然后根据茜素红浓度标准曲线计算矿化物质的量。结果连续成骨诱导21d后，肉眼可见孔底圆形不透明钙化结节，经茜素红染色后呈红色，FGFRl-DN组BMSCs在对数生长期经成骨诱导培养，其成骨能力明显增加，而FGFRl组成骨能力减弱。茜素红浓度含量FGFRl-DN组最高（1．33±O．19），FGFRl组最低（1．00±1．17），空载体转染组（1．20±0．16）和未转染组（1．17±0．17）介于二者之间，组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论FGFRl-DN在BMSCs分化的早期可以促进细胞增殖，于对数生长期进行骨诱导培养后实现了其在成骨细胞中促进矿化的作用，这为局部基因治疗骨折骨缺损提供了理论依据。

关键词：骨髓细胞成纤维细胞生长因子受体1 显性失活矿化

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敲降clock1a对斑马鱼per基因表达和运动行为节律的影响

敲降clock1a对斑马鱼per基因表达和运动行为节律的影响

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作者：沈莹苏州大学

学位级别：硕士

在自然界中，无论从低等的细菌还是到高等动物甚至人类，都存在近似24小时的昼夜节律，称为生物钟。生物钟对如体温变化、睡眠周期、肝脏代谢及激素分泌等多种基本的生理过程都具有调控作用。生物钟紊乱会导致一系列疾病，例如睡眠障碍... 详细信息

在自然界中，无论从低等的细菌还是到高等动物甚至人类，都存在近似24小时的昼夜节律，称为生物钟。生物钟对如体温变化、睡眠周期、肝脏代谢及激素分泌等多种基本的生理过程都具有调控作用。生物钟紊乱会导致一系列疾病，例如睡眠障碍、代谢失调、提前衰老及各种心理疾病等。因此揭示生物钟的分子机制及其调控网络，对解释正常生理生化行为及生物钟紊乱所引发的相关疾病的防治有十分重要的意义。生物钟的分子机制主要是存在一个细胞自主调控的转录翻译反馈环路。该环路中存在一对正向调节因子：CLOCK和BMAL，两者结合形成异二聚体，通过结合到负向调节因子per和cry启动子的E/E’-box元件来激活其转录。随后，PER蛋白和CRY蛋白结合形成复合体并进入细胞核内，作用于CLOCK: BMAL异二聚体，从而反馈抑制自身转录。 clock基因是第一个通过大规模突变体筛选获得的脊椎动物生物钟基因，其蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）-PAS转录因子家族，包含三个功能域，bHLH域，主要作用是DNA结合和蛋白二聚化;PAS域，是一个蛋白相互作用和信号转导的结构域和位于C端的谷氨酰胺富含域，主要作用是转录激活。显性失活技术是一种常见的基因敲降技术，本实验拟利用显性失活原理在斑马鱼体内过表达显性失活突变Clock1a蛋白，该蛋白仅包含bHLH和PAS域而缺失C端的转录激活域，该突变蛋白能与正常Clock1a蛋白竞争性结合Bmal蛋白，从而使内源Clock1a蛋白下调，影响整个生物钟反馈环路。基于此原理我们构建并获得了斑马鱼clock1a显性失活转基因系。通过荧光定量PCR法，我们确定了斑马鱼clock1a显性失活转基因系阳性F0代的外源片段拷贝数。通过原位杂交技术及荧光定量PCR技术，证明clock1a显性失活片段在转基因系体内高表达，而正常clock1a的表达水平并未受到影响。对下游per基因表达情况的检测结果显示，per基因在转基因系中表达量明显下调，证明在斑马鱼中4个per的表达受clock1a调控。行为学检测发现，在正常光暗条件下，转基因系活动量高于野生型;恒暗条件下，相较于野生型，转基因系运动节律相位有前移现象，提示clock1a敲降可能导致了类似人类躁狂症的行为。本研究成功构建了clock1a显性失活转基因斑马鱼，初步探究了内源clock1a竞争性活性下调对斑马鱼per基因的表达和行为节律的影响。同时本研究利用TALEN技术，建立了可遗传的clock1a斑马鱼突变体。为进一步研究clock1a的作用机制及其对下游生理过程的调控机理奠定了研究基础。

关键词： clock1a 显性失活转基因斑马鱼 TALEN 突变体

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