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微流控芯片法检测单细胞水平SNP及苯乙烯易感性生物标志物的研究

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微流控芯片法检测单细胞水平SNP及苯乙烯易感性生物标志物的研究

作者：王翠娟山东省医学科学院

学位级别：硕士

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)研究是目前人类基因组研究的一个热点,如果得出某些SNP或某些SNP的特定组合与某些疾病、地区发病人群乃至个别患者有明显相关性,疾病的预防和治疗将可以更有针对性,甚至做到个体化... 详细信息

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)研究是目前人类基因组研究的一个热点,如果得出某些SNP或某些SNP的特定组合与某些疾病、地区发病人群乃至个别患者有明显相关性,疾病的预防和治疗将可以更有针对性,甚至做到个体化。因此,SNP的开发对于目前医学领域的研究具有极大的潜力,而建立高度自动化和高通量的SNP检测分析技术也就具有十分重要的意义。虽然大多数传统SNP检测方法都有检测速度较慢或操作步骤复杂的缺点,但随着生物化学的迅速发展,许多新兴的高通量SNP检测技术在近年来应运而生,并且得到不断的发展。其中,起源于分析化学领域的微流控芯片技术在近年来发展迅猛并开始在医学领域发挥重要作用。微流控芯片技术不仅可以提高分析速度、增加分析效率、大大降低样品和试剂消耗,而且可使分析过程自动化、排除人为干扰、防止污染以及完成自动高效的重复实验。 SNP的研究在职业病预防方面的应用已显示出了广阔的前景,从分子水平探讨毒物作用机制,对因某基因缺失或突变而导致对某些工业毒物易感的个体进行基因预防,可用于高危人群的筛检和监测及毒物危险度评价,有助于发展新的疾病预防策略等。因此,SNP可以作为易感性生物标志物(biomarker of susceptibility),用来反映机体先天或后天获得的对接触外源性物质的反应能力。苯乙烯是工作场所中常见的化合物,在体内的代谢过程与其在体内增毒、解毒过程密切相关。研究发现,苯乙烯在体内经生物转化排出体外的代谢过程由多种生物代谢酶参与,代谢酶的催化活性受其基因多态性的调控,因此这些酶的基因多态性在很大程度上影响到苯乙烯在体内的代谢,从而影响其对机体的毒性损害作用。【研究目的】 1.以微流控芯片为检测平台,建立在单细胞水平检测单核苷酸多态性的方法,并对影响单细胞二重巢式聚合酶链反应的因素进行初步探讨。 2.探讨代谢酶基因多态性与苯乙烯代谢的关系,探寻苯乙烯职业危害的易感性生物标志物,为职业暴露人群的筛选、高危人群的健康监护提供理论依据,从而达到进一步加强病因预防的目的。【研究方法】 1.抽取健康成人静脉血分离单个淋巴细胞,分别采用不同的细胞裂解方法制备单细胞DNA模板,然后应用巢式聚合酶链反应扩增CYP2B6基因目标片段,利用微流控芯片检测基因型,以常规的琼脂糖凝胶电泳技术对检测结果进行验证,并比较两种检测方法的检测速度和灵敏度。 2.选择职业接触苯乙烯工人为研究对象,以微流控芯片为检测平台,检测CYP2B6,CYP2D6,GSTP1和NAT2的位点多态性,统计分析四种生物代谢酶不同基因型对苯乙烯代谢的影响,筛选出遗传易感基因。【研究结果】 1.实验结果表明,酶裂法制备单细胞DNA模板效率最高,NPCR-微流控芯片方法基因分型结果与普通PCR-琼脂糖凝胶电泳方法完全一致,且基于微流控芯片的检测方法比琼脂糖凝胶电泳方法灵敏度更高,所需样品量更少,所需时间时间仅为其1/4,并且能自动对DNA片段进行定性、定量分析,是一种高效、低耗、灵敏、快速、重复性好的检测技术。 2.以58名苯乙烯接触者外周血为样本,测定四种生物代谢酶基因型,结果发现:在高暴露组中, CYP2B6(exon4,G516T)野生基因型尿中苯乙烯的代谢产物含量高于突变基因型受试工人,具有显著性差异(P物含量无显著性差异(P>0.05)。【研究结论】 1.应用单细胞PCR-微流控芯片技术可有效地对单细胞水平SNP位点进行基因分型,是一种快速、高效、低耗且结果可靠的方法。 2.在携带CYP2B6和GSTP1不同基因型的研究对象中,尿中苯乙烯代谢产物含量差异具有显著性,因此,建议CYP2B6和GSTP1作为苯乙烯遗传易感性标志物,用于苯乙烯职业禁忌症的筛选。

关键词：单核苷酸多态性单细胞巢式聚合酶链反应微流控芯片苯乙烯易感性生物标志物

甲醛-DNA加合特性及其易感性生物标志物的研究

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甲醛-DNA加合特性及其易感性生物标志物的研究

作者：程学美山东省医学科学院

学位级别：硕士

甲醛职业暴露和环境暴露已经是一个严重的公共卫生问题,甲醛暴露可引起人体免疫系统、呼吸系统、神经系统、心血管系统及皮肤、肝脏等器官的损害。高浓度甲醛是一种遗传毒性物质,2004年6月世界卫生组织的国际癌症研究中心(IARC)发表的... 详细信息

甲醛职业暴露和环境暴露已经是一个严重的公共卫生问题,甲醛暴露可引起人体免疫系统、呼吸系统、神经系统、心血管系统及皮肤、肝脏等器官的损害。高浓度甲醛是一种遗传毒性物质,2004年6月世界卫生组织的国际癌症研究中心(IARC)发表的报告称,高浓度的甲醛能够导致人类耳、鼻、咽喉癌,同时还提到也可能导致白血病,已经确认甲醛是一种人类致癌物(group I)。常温下甲醛是一种无色,具有强烈刺激性的气体,易溶于水,其35%-40%的水溶液通称为福尔马林,常作为浸渍标本的防腐剂。甲醛具有正电性,分子里含有羰基(>C=O),可发生亲核加成、氧化、还原、歧化等反应,是一种化学性质比较活泼的小分子醛类化合物,活泼的醛基使得它们不需经过代谢就能攻击亲核基团,如核酸和蛋白质等生物大分子物质,形成DNA加合物或DNA蛋白质交联(DPC),引起DNA链间交联、DNA链断裂等遗传损害。而在一定条件下,DNA的损伤可能成为肿瘤发生的启动因素。随着分子生物学理论和技术的迅速发展,生物标志物(Biomarker)的研究作为一个崭新的领域逐渐引起了国内外预防医学界的共同关注。生物标志物所反映的是生物体系与环境因子(化学的、物理的或生物学的)相互作用引起的生理、生化、免疫和遗传等多方面的改变,是环境医学发展到分子水平的重要里程碑,它的研究在分子流行病学、分子毒理学、劳动卫生学、环境医学等诸多领域中均具有极其重要的价值。DNA加合物是生物有效剂量(到达剂量或靶剂量)标志物,反映靶细胞分子内接触剂量的生物标志物,它是毒性化合物进入人体后与细胞DNA相互作用而形成的。DNA加合物被认为是化学致癌、致畸、致突变过程的关键,它一旦逃避了自身修复就可能成为"三致"作用的最小因子。易感性生物标志物(Biomarker of susceptibility)指反映机体先天或后天获得的对接触外源性物质产生反应能力的指标,如血清α-1-抗胰蛋白酶缺乏者,接触呼吸道刺激剂,易引起肺气肿;有机磷农药中毒时胆碱酯酶活性抑制等等。基因多态性可以作为易感性分子生物标志物,是指如碱基替换、切除/插入和基因复制/切除等引起的DNA序列变异,它们可导致蛋白功能和表型的改变,表现为许多酶都存在同工异构酶的现象。由于生物代谢酶的不同形态在外源性化合物对机体毒性作用的过程中起着不同的作用,决定了机体对化学毒物的易感性。美国国立环境卫生科学研究所(NIEHS)和我国已启动环境基因组计划(Environmental Genomic Project,EGP) ,该计划应用人类基因组计划所使用的方法,旨在探讨环境-基因的相互作用,寻找对环境因素损伤的易感基因及环境反应基因的多态性在疾病病因和发病过程中的作用,鉴定与环境相关疾病的易感等位基因多态性等。基因多态性的研究在职业病预防方面的应用已显示广阔前景,可从分子水平探讨毒物作用机制,对毒物作用性质加速鉴定;可用于高危人群的筛检和监测;对因某基因缺失而导致对某些特定工业毒物易感的个体可以采用基因强化办法,进行基因预防;同时还有助于发展新的疾病预防策略,还可应用于危险度评价等等。由于遗传变异造成个体对甲醛代谢解毒易感性的差异,我国的职业甲醛接触标准还没有能够对遗传易感性人群采取有效的保护措施,并且在遗传易感性差异影响甲醛解毒效应方面还未展开研究。【研究目的】1.从分子水平上探讨体外测试系统中甲醛DNA加合特性,及染毒细胞中甲醛DNA加合物的形成,为接触人群的早期生物学监测、预防及危险性评价提供理论依据。2.探讨基因多态性和甲醛代谢易感性的关系,探寻甲醛职业危害的易感性生物标志物,为职业暴露人群的筛选、高危人群的健康监护提供科学的理论依据,以达到进一步保护甲醛接触者健康,加强职业危害一级预防的目的。【研究方法】1.应用体外试管反应、HPLC分析的方法,研究甲醛DNA的加合特性,包括DNA加合物的形成、DNA的加合位点、DNA加合物的化学键型以及加合反应的反应级数等。2.通过体外细胞染毒的方式,应用紫外吸收光谱移动法探讨甲醛在健康成人外周血淋巴细胞中DNA加合反应的特性,从而证实甲醛诱导人淋巴细胞DNA的加合效应及对哺乳动物细胞的损伤作用。3.采用横断面分子流行病学设计,选择107名甲醛职业工人,以PCR-RFLP方法检测ALDH2、CYP2E1遗传多态性,同时测定接触剂量空气中甲醛的浓度、班末尿中甲酸含量,统计分析基因多态性对甲醛代谢的影响。【研究结果】1.本研究结果

关键词：甲醛 DNA加合物 HPLC法紫外光谱移动法 PCR-RFLP ALDH2 CYP2E1 易感性生物标志物

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地方性砷中毒生物标志物研究进展

中华地方病学杂志 2023年第1期42卷 80-86页

作者：李梦昕郭志伟内蒙古医科大学公共卫生学院呼和浩特010080 内蒙古自治区综合疾病预防控制中心业务处呼和浩特010080

砷的蓄积效应及低砷暴露均可对砷中毒病区人群造成持续健康损伤,砷中毒的早期诊断与预防成为当前防控的重点,而生物标志物在疾病的早期诊断与预防中具有重要应用价值。因此,敏感特异的砷中毒生物标志物筛选及应用对于砷中毒的持续消除... 详细信息

砷的蓄积效应及低砷暴露均可对砷中毒病区人群造成持续健康损伤,砷中毒的早期诊断与预防成为当前防控的重点,而生物标志物在疾病的早期诊断与预防中具有重要应用价值。因此,敏感特异的砷中毒生物标志物筛选及应用对于砷中毒的持续消除具有重要意义。本文对地方性砷中毒生物标志物的研究进展进行综述,以期为地方性砷中毒的持续防控、早期监测与预警提供参考依据。

关键词：砷中毒生物标志物暴露生物标志物效应生物标志物易感性生物标志物

食管癌易感性与CYP1A1基因多态性和环境因素的关系

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中华实验外科杂志 2009年第12期26卷 1749-1750页

作者：邓彦超张晨陈艳张慧霞马彦清居来提新疆医科大学第一附属医院乌鲁木齐830011 新疆食管癌研究所新疆医科大学公共卫生学院新疆伊犁洲友谊医院新疆伊犁州新华医院

除很少一些疾病纯粹由遗传（如先天性遗传病）或环境因素（如车祸）引起外，绝大多数疾病是遗传和环境因素共同作用的结果，尤其是对于复杂性状的慢性病，基因和环境因素的交互作用在其中扮演着十分重要的“角色”。本研究对新疆汉族人... 详细信息

除很少一些疾病纯粹由遗传（如先天性遗传病）或环境因素（如车祸）引起外，绝大多数疾病是遗传和环境因素共同作用的结果，尤其是对于复杂性状的慢性病，基因和环境因素的交互作用在其中扮演着十分重要的“角色”。本研究对新疆汉族人群CYP1A1 rs1048943位点采用聚合酶链式反应．连接酶检测反应（PCR—LDR）技术进行检测，分析其基因多态性和环境因素及其交互作用与食管癌易感性的关系，为进一步认识食管癌的发病机制并寻找易感性生物标志物及制定食管癌预防措施提供实验依据。

关键词： CYP1A1基因多态性环境因素癌易感性食管癌聚合酶链式反应先天性遗传病易感性生物标志物交互作用

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锰职业接触工人生物标志物的研究

锰职业接触工人生物标志物的研究

作者：张文静山东大学

学位级别：硕士

锰是机体代谢的必需微量元素之一,适量的锰在体内充当某些酶的活性基团、激活因子等,同时参与中枢神经的生理功能。锰及其化合物又是重要的工业原料,应用广泛,常用于电焊作业以增强焊接的硬度和强度。工业中锰过量接触会导致职业性锰中... 详细信息

锰是机体代谢的必需微量元素之一,适量的锰在体内充当某些酶的活性基团、激活因子等,同时参与中枢神经的生理功能。锰及其化合物又是重要的工业原料,应用广泛,常用于电焊作业以增强焊接的硬度和强度。工业中锰过量接触会导致职业性锰中毒的发生,对机体的神经、免疫、生殖等各方面造成损伤。我国锰的消耗量超过千万吨,职业性慢性锰中毒的发生率较高,给国家造成巨大经济损失。目前慢性锰中毒无经济有效的治疗方法,而且国家对其诊断无统一有效的标准,早期外周组织相应的标志物检测亦无相应的有力证据。之前的大多数研究都是检测工作场所周围空气中的平均锰浓度,而忽略了个体锰实际暴露剂量的测定。本课题即是从个体锰实际暴露剂量出发,研究暴露剂量与生物材料中各指标之间的相关性,以寻找合适的生物标志物为锰的接触评价提供依据。目的建立一种能同时测定人尿液中高香草酸和香草扁桃酸含量的高效液相色谱荧光检测方法,并探讨锰接触工人个体实际接触剂量与生物指标之间的关系以寻找合适的早期生物学监测指标。方法本课题选择济南市某机车车辆厂电焊作业工人270名,其中男238人,女32人,均排除各种肝、肾疾病,无其他毒物接触史,无长期药物服用史。收集此270人的血液和尿液进行分析。对尿液中高香草酸和香草扁桃酸的测定进行方法学摸索和验证。根据文献参考,选择高效液相色谱-荧光检测器的方法测定。尿样经0.45μm滤膜过滤后直接进样,经ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm,5.0μm）室温分离,以甲醇-0.1 mol/L pH=5.6的磷酸盐缓冲液（体积比20:80）为流动相,流量1 ml/min,进样量10μl,激发波长277 nm,发射波长320 nm。火焰原子吸收光谱法测定血锰、尿锰和个体锰暴露剂量;高效液相色谱-荧光法测定尿中高香草酸和香草扁桃酸;从血液中提取DNA进行谷氨酸脱羧酶67（GAD67）和血红素加氧酶-1（HO-1）基因多态性分析,GAD67采用PCR结合限制性内切酶（MnlⅠ）进行片段长度多态性（RFLP）分析;HO-1则通过研究启动子（GT）序列的长度进行多态性分析。对各指标进行相关性研究和方差分析。结果尿中高香草酸和香草扁桃酸的分离测定过程在15 min之内完成,香草扁桃酸、高香草酸保留时间分别为3.18、6.54 min。高香草酸检出限为0.15μg/ml。线性范围0～25μg/ml,加标回收率84.5%～102.1%,相对标准偏差＜3.44%。香草扁桃酸检出限为0.13μg/ml,线性范围0～20μg/ml,加标回收率94.7%～101.3%,相对标准偏差＜2.16%。个体锰与血锰、尿锰之间均无相关性,提示血锰、尿锰均不能作为评价锰实际接触剂量的指标,即不能作为评价锰接触的暴露生物标志。个体锰暴露剂量与尿HVA之间有负相关性（r=-0.168,P＜0.01）,且有显著统计学意义;与尿中HVA、VMA的均值有负相关性（r=-0.172,P＜0.01）,且有显著统计学意义。提示尿HVA、尿中二酸均值随着个体锰接触剂量的增加呈下降趋势,二者均可以作为职业性锰中毒诊断的效应生物标志物指标评价锰接触的情况。 DNA经扩增、MnlⅠ酶切后将GAD67分为CC、TC、TT三种基因型,共测定132份样品。按个体锰暴露将其分为高、低两组,分析组内各基因型对应的工人尿HVA、HVA与VMA均值之间的差异。方差分析结果无统计学差异,提示GAD67的MnlⅠ酶切位点不能作为评价锰接触的遗传易感性生物标志。 DNA经扩增、银染后将HO-1的启动子重复序列长度分为S/S,S/M,S/L,M/M,M/L和L/L六种基因型,共测定样品132份。按个体锰暴露将其分为高、低两组,分析组内各基因型对应的工人尿HVA、HVA与VMA均值之间的差异,方差分析结果无统计学差异。按是否含有L等位基因把六种基因型分为两类基因型,比较两组内工人尿HVA、HVA与VMA均值之间的差异,t检验结果显示两组内的两类基因型之间均有统计学差异,提示HO-1基因的L等位基因可以作为评价锰接触的遗传易感性生物标志。结论本实验样品前处理简单,样品稳定,保存时间长;方法灵敏度高、重现性好。完成一次样品分析需要15 min,标准曲线线性良好。方法各项指标均达到《生物材料分析方法的研制准则》的要求,能准确测定尿液中高香草酸和香草扁桃酸的含量,适用于大批样品的测定。血锰、尿锰均不能作为评价锰接触的暴露生物标志;尿HVA、尿中HVA与VMA的均值都可以作为评价锰接触的效应生物标志,尿VMA则不可以;年龄、性别是锰接触效应发生的重要影响因素。GAD67 MnlⅠ型酶切位点不能

关键词：锰暴露生物标志物效应生物标志物易感性生物标志物

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生物标志物在环境肿瘤分子流行病学应用进展

浙江预防医学 2007年第11期19卷 54-56页

作者：杨东平何继亮嘉兴学院医学院基础部浙江嘉兴314001

环境肿瘤分子流行病学研究中,生物标志物对于环境致癌物的暴露估计、危险评价和预测等方面起了重要作用,因此得到广泛应用.

关键词：易感性生物标志物肿瘤分子流行病学环境致癌物效应生物标志物危险评价蛋白组学基因组学

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接触氯乙烯的生物标志物

国外医学（卫生学分册） 2003年第2期30卷 87-91页

作者：王爱红复旦大学公共卫生学院上海200032

氯乙烯是一种可损害多器官的毒物 ,也是已知人类致癌物。其活性代谢中间产物具有强烈烷化作用 ,可在体内形成多种加合物。以氯乙烯的代谢和毒性机制为基础 ,研究了一系列其致机体损伤的指标 ,并试图寻找氯乙烯的生物标志物。本文就氯乙... 详细信息

氯乙烯是一种可损害多器官的毒物 ,也是已知人类致癌物。其活性代谢中间产物具有强烈烷化作用 ,可在体内形成多种加合物。以氯乙烯的代谢和毒性机制为基础 ,研究了一系列其致机体损伤的指标 ,并试图寻找氯乙烯的生物标志物。本文就氯乙烯在体内的代谢转归及其活性中间产物、接触生物标志物、遗传学改变。

关键词：氯乙烯活性代谢中间产物接触生物标志物效应生物标志物易感性生物标志物

镉接触工人外周血淋巴细胞的金属硫蛋白基因表达

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