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肠道病毒71型VP1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2015年第9期31卷 1230-1233页

作者：赵培培孔枕枕刘海冰茅凌翔苏兆亮仝佳王胜军陈建国江苏大学检验医学研究所江苏镇江212013 江苏大学附属人民医院检验科江苏镇江212002 镇江市疾病预防控制中心检验科江苏镇江212001

目的利用昆虫杆状病毒表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化。方法首先通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组... 详细信息

目的利用昆虫杆状病毒表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化。方法首先通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组质粒pFast Bac1-VP1转入DH10BacTM感受态细胞,通过转座从而获得重组质粒bacmid-VP1,采用脂质体Cellfectin Reagent将重组质粒bacmid-VP1转染Sf9细胞。通过SDS-PAGE、Western blot法检测目的蛋白的水平,经镍离子亲和层析,纯化VP1蛋白。结果 SDS-PAGE及Western blot法检测获得蛋白的相对分子质量与预期结果一致。Bradford分析纯化后蛋白的浓度为70μg/m L,纯化度达90%。结论利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白。

关键词： EV71 VP1蛋白昆虫-杆状病毒表达系统

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白的表达及其体外生物活性研究

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生物工程学报 2004年第4期20卷 536-539页

作者：李文生郑瑾刘红莉陈宏伟杨军王一理司履生西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所环境与疾病相关基因教育部重点实验室西安710061 西安交通大学陕西临床学院

利用PCR技术克隆截短型HPV5 8L1基因并重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac Htb ,通过转座反应 ,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组 ,分离重组的BacmidDNA ,并转染Sf 9昆虫细胞 ,收集被转染的Sf 9细胞 ,提取细胞蛋白 ,SDS PAGE检... 详细信息

利用PCR技术克隆截短型HPV5 8L1基因并重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac Htb ,通过转座反应 ,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组 ,分离重组的BacmidDNA ,并转染Sf 9昆虫细胞 ,收集被转染的Sf 9细胞 ,提取细胞蛋白 ,SDS PAGE检测可见在大约 5 8Kda处出现一新生蛋白条带 ,Westernblot证实为HPV5 8L1蛋白。用ProBondTM 纯化系统纯化所表达的蛋白。小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白可介导小鼠红细胞凝集 ,透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结果表明昆虫杆状病毒表达系统可高效表达截短型HPV5 8L1蛋白 ,纯化后的截短型HPV5 8L1蛋白在体外可自组装VLP 。

关键词：截短型HPV58 L1蛋白昆虫-杆状病毒表达系统蛋白纯化病毒样颗粒

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基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒的制备与鉴定

中国兽医学报 2016年第1期36卷 18-23页

作者：袁乾亮钱晶薛聪穆昱丁壮吉林大学动物医学学院吉林长春130062

利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统分别构建了含有新城疫强毒株M、F、NP和HN等4个结构基因的单顺反子重组杆粒,经转染后,观察Sf9细胞病变以及PCR鉴定结果表明成功构建了4种重组杆状病毒;收集重组杆状病毒采用共感染策略,Sf9细胞上... 详细信息

利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统分别构建了含有新城疫强毒株M、F、NP和HN等4个结构基因的单顺反子重组杆粒,经转染后,观察Sf9细胞病变以及PCR鉴定结果表明成功构建了4种重组杆状病毒;收集重组杆状病毒采用共感染策略,Sf9细胞上清经超速离心,蔗糖密度梯度纯化与浓缩后,利用Western blotting方法和透射电子显微镜技术检测,结果表明目的蛋白均正确表达且组装成具有完整囊膜形态的病毒粒子。

关键词：新城疫病毒样颗粒新型疫苗昆虫-杆状病毒表达系统

PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究

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PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究

作者：闫飞虎中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)俗称羊瘟,又被称为小反刍兽假性牛瘟,是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性或亚急性传染病。世界动物卫生组织(The World Organization for Animal Health,OIE)将其列为必须通报疫病,我国将其列为一类动物疫病。2007年7月在我国西藏阿里地区出现了中国首例小反刍兽疫,2014年我国大面积爆发小反刍兽疫,波及20余省份,给当地养羊业造成巨大经济损失。此外,小反刍兽疫经空气传播,最易感的是小反刍动物,尤其野生小反刍动物不受国界限制,很容易造成全球性蔓延,所以有效的预防显得尤为重要。弱毒疫苗是OIE规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗,然而PPRV对热非常敏感,疫苗在保护和运输过程中保持冷链状态相对较为困难。此外,减毒活疫苗还存在毒力返强的风险,这就限制了PPR弱毒疫苗的大规模田间使用,因此迫切需要开发一种安全有效、热稳定性好的疫苗候选。相比弱毒疫苗与灭活疫苗,病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗成为安全稳定的疫苗候选者之一,病毒样颗粒是由病毒一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒。在形态上,VLPs类似于真实的病毒粒子,但是由于缺乏具有感染性的核酸,故无复制和感染能力。虽然病毒样颗粒不具有感染性,但VLPs具有类似于天然病毒的理化性质,能被抗原提呈细胞摄取加工提呈,激发细胞免疫反应和体液免疫应答,具有安全性高和免疫原性好的优点。流感VLPs疫苗、乙型肝炎VLPs疫苗及猪圆环病毒2型VLPs疫苗都已进入临床试验或者已被比准上市。但目前为止,有关小反刍兽疫病毒病毒样颗粒(PPRV VLPs)构建研究的报道较少。因此,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产不同毒株的PPRV VLPs,并对其免疫原性进行研究比较,选取免疫原性好的毒株的病毒样颗粒进行本动物免疫,为开发安全、有效的小反刍兽疫病毒样颗粒候选疫苗奠定基础。第1章:小反刍兽疫M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备本研究以PPRV疫苗株Nigeria 75/1株为研究对象,分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物,通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段,将编码序列大小分别为1005 bp PPRV M基因片段克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,将编码序列大小分别为1653 bp和1245 bp的PPRV F、H基因片段分别克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H。将各表达质粒转化宿主菌Transetta(DE3),表达条件经优化后最终确定为0.4m M IPTG和37℃条件下诱导表达4h,经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为61 k D、66 k D和60 k D的重组蛋白,大小与预期相符,主要以不溶性包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示M、F、H重组蛋白均能被绵阳抗PPRV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫昆明鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV M、F和H蛋白多克隆抗体,为后期鉴定重组杆状病毒奠定了基础。第2章:小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F和rp FB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以三种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。电镜下可以到80-100nm左右的病毒样粒子,且表面纤突明显。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D和68k D左右的条带,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。第3章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株(Gen Bank Access ***905304.1)M、F、H和N基因,构建

关键词：小反刍兽疫病毒多克隆抗体昆虫-杆状病毒表达系统病毒样颗粒共表达共感染中和抗体滴度

兔病毒性出血症病毒病毒样颗粒的制备及RK13细胞cDNA表达型文库的构建

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兔病毒性出血症病毒病毒样颗粒的制备及RK13细胞cDNA表达型文库的...

作者：宋毅浙江师范大学

学位级别：硕士

兔瘟是对养兔业造成最大危害的一种重要病毒性传染病,具有高度接触性致死性。其病原体是兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV),属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。杯状病毒科病毒具有较广的宿主范围... 详细信息

兔瘟是对养兔业造成最大危害的一种重要病毒性传染病,具有高度接触性致死性。其病原体是兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV),属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)。杯状病毒科病毒具有较广的宿主范围,能引起多种动物和人类疾病。杯状病毒侵入宿主细胞是病毒进行感染的首要环节,杯状病毒首先需要与受体结合,之后通过细胞内吞作用进入细胞。关于杯状病毒的细胞受体,目前只在少数几个种属中获得了一定的进展,但关于RHDV的细胞受体仍是一片空白。为了筛选和鉴定RHDV的细胞受体,我们利用杆状病毒表达系统表达了RHDV的衣壳蛋白(VP60),纯化获得了病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)以及利用SMART方法构建了RHDV的宿主细胞-RK13细胞的cDNA真核表达文库。*** JX/97分离株VLPs的制备以实验室保存的JX/97分离株全长cDNA分子克隆质粒pB1RHDV为模板,设计并合成了覆盖JX/97分离株基因组中vp60的含酶切位点的引物对,通过PCR扩增获得vp60基因,将基因片段双酶切后分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBac1上。重组质粒转化DH10Bac后发生转座,通过“三抗”板和蓝白斑法筛选到阳性克隆后,提取重组Bacmid DNA,转染Sf9细胞,6天后收集上清,用上清重新感染新的Sf9细胞,依次感染细胞2次。待Sf9细胞发生明显病变时,收集上清即为重组杆状病毒,取部分用于检测或扩大培养。间接免疫荧光和Western Blot检测结果表明重组蛋白在Sf9细胞中正确表达,进一步的电镜观察显示重组病毒感染的Sf9细胞内以及纯化的重组蛋白都能自我组装形成VLPs。2. RHDV JX/97分离株宿主细胞RK13 cDNA真核表达文库的构建以兔肾细胞系RK13为材料提取细胞总RNA,然后用链霉亲和素磁珠(SA-PMP)分离纯化获得mRNA。利用SMART技术,即以SMART IV Oligonucleotid作为接头,在3末端加上一段序列,再利用CDSIII/3'PCR Primer尽量将mRNA全部反转录成cDNA,从而获得了全长cDNA的第1链,用LD-PCR方法扩增双链cDNA。经SfiⅠ酶切后过柱分级收集ds cDNA,选取大片段ds cDNA(>500bp),核酸沉淀后克隆到SfiⅠ酶切的真核表达载体pEXP-Lib中。最后,利用电转仪1.8KV 200Ω25μF,电转化至宿主菌电转感受态细胞(DH5α)获得了cDNA文库,通过计算文库的库容量达到2.55×105CFU,随机挑取16个克隆,用合成的载体上的测序引物PCR扩增,发现插入的cDNA片段大小在400-2250 bp之间,插入片段的平均长度约1.0 Kb。以上结果表明,利用RHDV宿主细胞RK13为材料,构建了一个较高质量的全长cDNA真核表达文库,库容量达2.55×105 CFU,可以满足后续工作的需要。表达获得的RHDV空衣壳蛋白及其宿主细胞RK13全长cDNA真核表达文库的构建,为进一步利用空衣壳蛋白代替RHDV粒子,通过蛋白互作从全长cDNA真核表达库中筛选出受体蛋白奠定基础。

关键词： Rabbit Hemorrhagic Disease Virus 昆虫-杆状病毒表达系统病毒样颗粒 RK13 cDNA文库

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人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究

人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究

作者：张黎中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒A属,主要引起婴幼儿的手足口病,重症者出现病毒性脑炎、脑膜炎、肺水肿、肺出血,个别病例进展快速,迅速导致死亡。EV71病毒从1969年在美国加尼福尼亚最早被发现以来,至今... 详细信息

肠道病毒71型（Enterovirus 71, EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒A属,主要引起婴幼儿的手足口病,重症者出现病毒性脑炎、脑膜炎、肺水肿、肺出血,个别病例进展快速,迅速导致死亡。EV71病毒从1969年在美国加尼福尼亚最早被发现以来,至今一共引起了10多次的世界范围的爆发和流行,其中又有四次大的流行。从2008年安徽阜阳爆发EV71以来,卫生部发布《手足口病预防控制指南》并将手足口病纳入丙类传染病来管理。在丙类传染病中手足口病发病数位于第三,而死亡数为第一位。对EV71的感染临床上主要采用广谱抗病毒药物以及对症治疗,但目前没有针对EV71特效抗病毒药物,疫苗正处于研制阶段。所以研究EV71作为一种微生物致病原所引发的机体免疫应答,对明确发病机制、制定预防诊治策略具有重要意义。在EV71抗体的研究方面,目前仅有鼠源的单克隆中和性抗体的报道,而鼠源抗体本身就存在很多缺陷,从而限制了其很多的应用。本文采用了pHAL14系统,构建了人源抗EV71病毒sc-Fv单链抗体基困库,并利用原核表达纯化的VP1蛋白筛选获得了1株抗EV71病毒特异性人源sc-Fv单克隆抗体,并将其分别构建表达成为单链-Fc和IgG形式的全抗体,为进一步研究病毒免疫和抗体结合表位奠定了基础。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,筛选人源抗EV71病毒抗体,实验有以下两部分：一,人源抗EV71病毒scFV（?）笨菌体抗体库的构建与筛选采集9位EV71引起的手足口病患儿恢复期外周全血,分离淋巴细胞,然后提取总RNA并反转录成cDNA,接着用特异性的PCR引物经过两轮扩增特异性轻链和重链可变区基因,在对PCR产物鉴定和纯化后,用轻链基因与噬菌粒pHAL14构建了轻链库,随后将重链基因克隆入轻链库中构建scFv噬菌体抗体库。最后使用辅助噬菌体对scFv噬菌体抗体库进行包装,检测库容量,结果表明我们所构建scFV（?）噬菌体抗体库的容量为4.0×108,轻链插入率和重链插入率均为100%,满足筛库的需要。在成功构建scFv噬菌体抗体库的基础上,用原核表达纯化的VP1蛋白对噬菌体抗体库进行富集筛选,利用ELISA、IFA以及Western Blot对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,并通过序列测定确定所获抗体的基因序列,然后与Genebank报道的抗体序列进行比较,根据抗体基因序列推断出其氨基酸序列,与vbase database中抗体序列信息比较,确定其CDR区。结果获得1株scFv抗体,一系列功能试验均证明该抗体是特异针对EV71 VP1蛋白。二,人源抗EV71病毒全抗体表达及功能鉴定在原核表达scFv抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和昆虫杆状病毒载体技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将该EV71抗体的轻链和重链的可变区基因插入杆状病毒载体pCMX2.51和pAc-L-CH3R,然后将构建好的重组质粒转染293T细胞和与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,通过IFA检测转染效果,接着对昆虫细胞表达上清进行纯化。利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、Western Blot等方法检测纯化的抗EV71病毒IgG全抗的功能活性,结果表明该人源单克隆抗体特异性针对EV71病毒VP1蛋白。在和A型以及两株C4亚型EV71病毒进行中和试验,结果显示该抗体没有中和活性。综上所述,本研究运用噬菌体抗体库技术,成功构建了人源抗EV71病毒scFv噬菌体抗体库,筛选获得了1株特异性针对EV71病毒VP1蛋白的人源单链抗体。将该抗体构建为IgG全抗体,经IFA、Western Blot检测显示具有功能活性,与A型和C4亚型的病毒中和试验结果显示没有中和活性。

关键词： EV71病毒人源基因工程抗体噬菌体展示技术昆虫-杆状病毒表达系统