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西方蜜蜂AmAGO1蛋白的分子特性、时空表达谱及抗体制备

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昆虫学报 2024年第1期67卷 18-28页

作者：叶亚萍刘治滩李琪明臧贺冯佩林王宁王杰黄枳腱陈大福郭睿福建农林大学蜂学与生物医药学院福州350002 天然生物毒素国家地方联合工程实验室福州350002 福建省蜂疗研究所福州350002 四川省农业农村厅畜牧总站成都610041

【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本... 详细信息

【目的】Argonaute(AGO)家族是一类在进化上高度保守的蛋白家族,其在真核生物中主要参与形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),进而通过沉默基因表达参与诸多生物学过程。蜜蜂AGO蛋白的相关研究迄今仍然缺失。本研究拟通过预测西方蜜蜂Apis mellifera的AGO1(AmAGO1)理化性质和分子特性,解析AmAGO1在西方蜜蜂中的时空表达谱,并制备AmAGO1的多克隆抗体,为深入开展AmAGO1的功能与机制研究提供参考和基础。【方法】PCR扩增西方蜜蜂AmAGO1的编码序列(coding sequence,CDS);通过生物信息学预测AmAGO1蛋白的理化性质和分子特性;利用RT-qPCR检测AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、3日龄幼虫、7日龄预蛹、8日龄预蛹、12日龄蛹以及1,2,6,12,15和18日龄成虫以及工蜂成虫触角、咽下腺、脑、表皮、中肠、脂肪体和毒腺中的表达量;构建原核表达质粒后诱导表达AmAGO1融合蛋白,并鉴定其表达形式;制备AmAGO1多克隆抗体,利用ELISA,Western blot和免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分别检测抗体效价、灵敏度和特异性。【结果】成功克隆到西方蜜蜂AmAGO1的CDS;AmAGO1含928个氨基酸,分子式为C4624H7332N1316O1325S51,分子量约为104.2 kD,等电点为9.31,平均亲水系数为-0.2965,含86个磷酸化位点及典型的PAZ结构域和PIWI结构域,但不存在典型的信号肽;AGO1在智人Homo sapiens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、西方蜜蜂、东方蜜蜂A.cerana和欧洲熊蜂Bombus terrestris中具有较高的氨基酸序列一致性;西方蜜蜂和东方蜜蜂的AGO1聚为一支,同源性最高。AmAGO1在西方蜜蜂工蜂卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫中均有表达但表达量存在差异,3日龄幼虫和7日龄预蛹中AmAGO1的表达量显著低于卵中的表达量,而8日龄预蛹和12日龄蛹中AmAGO1的表达量显著高于卵中的表达量;AmAGO1在1,2,6,12,15和18日龄工蜂体内均有表达但表达量也存在差异,其中1日龄成虫体内AmAGO1的表达量显著高于其他日龄成虫体内的表达量;AmAGO1在工蜂成虫触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮中均有表达但表达量存在差异,触角中AmAGO1的表达量与咽下腺中的相差无几,但二者均显著高于毒腺、脑、中肠、脂肪体和表皮中AmAGO1的表达量;AmAGO1融合蛋白的表达形式为包涵体;制备的AmAGO1多克隆抗体具有较高的效价、灵敏度和特异性。【结论】AmAGO1可能是亲水性胞内蛋白,含有典型的PAZ结构域和PIWI结构域;AmAGO1在西方蜜蜂工蜂不同组织和不同发育阶段发挥潜在的重要功能;成功制备出高效价、高灵敏度和强特异性的AGO1多克隆抗体。

关键词：西方蜜蜂 AmAGO1 克隆分子特性时空表达谱原核表达多克隆抗体

水稻RBOHs家族成员时空表达谱及多病害抗性调控研究

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水稻RBOHs家族成员时空表达谱及多病害抗性调控研究

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：朱勇刘信娴王贺樊晶李燕王文明四川农业大学西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室

植物NADPH氧化酶(RBOHs)产生的活性氧(ROS)广泛参与生物与非生物胁迫触发的信号转导。据报道,水稻RBOHs家族含有9个成员(OsRBOHA-OsRBOHI)。实验室利用qRT-PCR对水稻所有OsRBOH家族基因进行全生育期不同组织表达模式分析,发现不同成员... 详细信息

植物NADPH氧化酶(RBOHs)产生的活性氧(ROS)广泛参与生物与非生物胁迫触发的信号转导。据报道,水稻RBOHs家族含有9个成员(OsRBOHA-OsRBOHI)。实验室利用qRT-PCR对水稻所有OsRBOH家族基因进行全生育期不同组织表达模式分析,发现不同成员在全生育期存在时空差异表达。对OsRBOHs的敲除突变体材料接种水稻主要病害病原菌,包括白叶枯菌、纹枯菌和稻瘟菌,发现除rbohf和rbohg突变体外,其他rboh突变体均对单个或多个病原菌显示不同程度的抗性降低,提示多个RBOH家族基因参与调控水稻主要病害。同时,对OsRBOHs基因敲除突变体材料的发育表型进行分析发现,所有家族基因均参与调控水稻生长发育或重要产量性状。我们的研究结果为后续研究水稻RBOH家族基因参与调控水稻抗病性及产量性状机制提供了理论基础。

关键词： OsRBOHs 时空表达谱多病害抗性产量性状

来源： cnki会议评论

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昆虫学报 2021年第12期64卷 1417-1426页

作者：梁玉键张涛李草郅军锐贵州大学昆虫研究所贵州省山地农业病虫害重点实验室贵阳550025

【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TP... 详细信息

【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的功能奠定基础。【方法】运用RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾SfTPS的全长编码区,并进行生物信息学分析。运用RT-qPCR技术检测SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(体壁、中肠和脂肪体)中和经短期(2,4和8 h)高(35℃)低温(10℃)胁迫后5龄幼虫中的表达变化。【结果】克隆获得2571 bp的草地贪夜蛾TPS cDNA序列,命名为SfTPS(GenBank登录号:MT920672),全长开放阅读框(ORF)长2481 bp,编码的826个氨基酸具有TPS和TPP两个保守结构域。同源比对和系统进化分析表明,昆虫TPS蛋白具有较高的保守性,SfTPS与斜纹夜蛾S.litura的TPS亲缘关系最近,序列一致性达到99.15%。SfTPS中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲占比分别为38.14%,12.23%和48.55%;SfTPS的三级结构为同源二聚体。RT-qPCR结果表明,SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期低表达,在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达,且草地贪夜蛾变态前后SfTPS的表达量变化较大。组织分布结果显示,SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达量最高。草地贪夜蛾5龄幼虫经2~8 h低温(10℃)和高温(35℃)胁迫后,SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃),分别为对照的4.43~9.34和2.50~6.03倍。【结论】SfTPS基因在草地贪夜蛾生长发育过程及抵御高低温度胁迫中可能具有重要作用。

关键词：草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因克隆时空表达谱温度胁迫

麦二叉蚜唾液蛋白基因Sg1655时空表达谱及其抑制小麦防御反应的功能

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植物保护学报 2024年第1期51卷 20-27页

作者：孙钰张雨濛刘晓蓓陈巨莲张勇解海翠河北科技师范学院河北省作物逆境生物学重点实验室秦皇岛066600 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害综合治理全国重点实验室北京100193

为进一步明确麦二叉蚜Schizaphis graminum唾液蛋白Sg1655在调控小麦防御反应中的作用,基于麦二叉蚜唾液腺转录组数据,利用PCR技术克隆获取Sg1655开放阅读框,利用生物信息学软件对其序列进行分析;通过实时荧光定量PCR(real-time quantit... 详细信息

为进一步明确麦二叉蚜Schizaphis graminum唾液蛋白Sg1655在调控小麦防御反应中的作用,基于麦二叉蚜唾液腺转录组数据,利用PCR技术克隆获取Sg1655开放阅读框,利用生物信息学软件对其序列进行分析;通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测Sg1655在麦二叉蚜不同组织及不同龄期中的表达;利用细菌III型分泌系统将Sg1655导入到小麦叶片内,检测其瞬时表达对小麦胼胝质积累的影响。结果表明,Sg1655开放阅读框全长375 bp,编码125个氨基酸残基,N端1~21位为信号肽序列,预测蛋白分子量为14.90 kD。麦二叉蚜Sg1655氨基酸序列与玉米蚜Rhopalosiphum maidis同源序列相致性最高,为89.52%;麦二叉蚜Sg1655与玉米蚜同源序列聚为一个分支,亲缘关系最近。Sg1655在麦二叉蚜各组织中均有表达,其中在唾液腺中表达量最高,Sg1655在麦二叉蚜各个龄期均有表达,且在不同龄期之间无显著差异。小麦叶片内Sg1655瞬时表达可显著抑制小麦胼胝质积累,表明该蛋白可作为潜在效应子参与抑制小麦防御反应。

关键词：麦二叉蚜唾液蛋白 Sg1655 基因克隆序列比对时空表达谱功能分析

伊蚊5-HT受体家族生物信息学分析和时空表达谱的构建

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热带生物学报 2021年第3期12卷 347-355,F0003页

作者：李妙珍李奕勋陈静张磊廖承红韩谦海南大学生命科学与药学院/热带动物医学与病媒生物学实验室海口570028

5-羟色胺(5-HT)可通过多个受体介导来调控昆虫的生长发育和运动等生理活动,也是新型杀虫剂潜在的靶点。本研究对埃及伊蚊的5-羟色胺受体家族进行系统分析,即利用生物信息学方法、进化分析5-HT受体在物种间的同源性,构建系统进化树;使用... 详细信息

5-羟色胺(5-HT)可通过多个受体介导来调控昆虫的生长发育和运动等生理活动,也是新型杀虫剂潜在的靶点。本研究对埃及伊蚊的5-羟色胺受体家族进行系统分析,即利用生物信息学方法、进化分析5-HT受体在物种间的同源性,构建系统进化树;使用同源建模的方法以人类5-羟色胺受体结构为模板,构建埃及伊蚊(Aedes aegypti)5-HT受体的三维结构模型;通过实时荧光定量PCR方法研究受体在埃及伊蚊幼虫期、蛹期和成蚊,未吸血雌蚊的头、胸、腹及附肢的表达情况。从NCBI和VectorBase数据库中得到埃及伊蚊的6个5-HT受体基因,生物信息学分析发现6个受体结构均具有7次跨膜区,其中在受体蛋白的二级结构中α-螺旋占有较高的比重。进化分析结果表明,埃及伊蚊5-HT受体基因分别位于3个不同的分支,各分支均与黑腹果蝇5-HT相应受体具有较高的同源性。表达谱构建结果表明,相比各龄幼虫和雌蚊,5-HT受体均在雄蚊中的表达量最高,且在雌蚊各组织中呈现明显的差异。5-HTR1B、5-HTR2B、5-HTR7B在头、胸、腹和附肢4种组织中均有表达;5-HTR1A在头、胸、腹中均有表达;5-HTR1D在胸腔中高表达,但在头部和附肢中不表达;5-HTR7A在附肢中表达丰度最高,而在头部无表达;该结果预示不同受体介导5-HT的功能可能不同。本研究明确了埃及伊蚊5-HT受体家族蛋白的序列特征、进化关系及组织表达特征,为埃及伊蚊5-HT受体功能的进一步研究奠定了基础。

关键词： 5-羟色胺埃及伊蚊生物信息分析时空表达谱

二化螟Halloween家族基因Cyp302a1和Cyp315a1的克隆与时空表达谱分析

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南京农业大学学报 2022年第2期45卷 287-296页

作者：张志凌王凯张茹徐晴玉罗光华方继朝南京农业大学植物保护学院江苏南京210095 江苏省农业科学院植物保护研究所/江苏省食品质量安全重点实验室(省部共建国家重点实验室培育基地) 江苏南京210014 扬州大学园艺与植物保护学院江苏扬州225009

[目的]Halloween家族基因参与合成蜕皮激素,调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程。二化螟(Chilo suppressalis)是水稻的重要害虫,明确二化螟Halloween家族基因完整序列及表达谱特征,对后续开展二化螟生长发育等调控机制研究具有重要作用。... 详细信息

[目的]Halloween家族基因参与合成蜕皮激素,调控昆虫发育、繁殖等重要生命过程。二化螟(Chilo suppressalis)是水稻的重要害虫,明确二化螟Halloween家族基因完整序列及表达谱特征,对后续开展二化螟生长发育等调控机制研究具有重要作用。[方法]利用反转录PCR(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆二化螟Halloween家族基因成员Cyp302a1和Cyp315a1的完整转录本序列;通过多重比对分析序列保守结构特征;利用MEGA 7.0软件构建了分子系统进化树;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析基因的时空表达谱。[结果]克隆获得二化螟Halloween家族2个基因CsCyp302a1和CsCyp315a1的全长cDNA序列。各基因均含有5个序列保守结构域:WxxxR(Helix-C)、GxE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和PFxxGxRxCxG/A(heme-binding domain),并且与各自的基因家族成员聚为一支。各基因在不同发育时期和不同组织内的表达水平存在差异,其表达模式在不同基因间也存在差异。二化螟Cyp307a1相对表达量最高,Cyp315a1相对表达量最低。Cyp307a1在头部表达量高;Cyp306a1在中肠表达量高;Cyp302a1和Cyp315a1在头部和表皮中表达量高;Cyp314a1在脂肪体和表皮中表达量高。[结论]明确了二化螟Halloween家族2个基因序列特征和全部5个主要基因的时空表达谱特征。

关键词：二化螟 Halloween家族基因基因克隆时空表达谱

中华蜜蜂NPC2基因家族克隆及表达模式分析

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中国农业科学 2022年第12期55卷 2461-2471页

作者：张莉张楠江虎强吴帆李红亮中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检疫检验技术重点实验室

【背景】作为我国本土重要的资源昆虫，中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值，其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现，与昆... 详细信息

【背景】作为我国本土重要的资源昆虫，中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值，其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现，与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】以中蜂NPC2家族基因为研究对象，克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异，为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】基于中蜂高、低温转录组测序结果，利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列，进行系统进化树分析和三维结构预测，然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱，以及高、低温时的表达量变化。【结果】获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长，分别为447、480、459和465 bp，编码148、159、152和154个氨基酸，预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD，等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近，与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示，AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高，其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期；AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高，在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达；AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达；AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后，4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升，但差异不显著。【结论】AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构，其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性，其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达，表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升，表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性，或与初冬季访花行为有关。

关键词：中华蜜蜂尼曼匹克C2型蛋白(NPC2) 基因克隆时空表达谱

西方蜜蜂mA甲基转移酶的基因克隆、多克隆抗体制备及表达模式

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昆虫学报 2023年 1-11页

作者：吴鹰刘治滩赵浩东郭思佳刘小玉张艺琼冯佩林赵红霞徐细建陈大福付中民郭睿广东省科学院动物研究所江西省养蜂研究所福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建省蜂疗研究所

[目的]本研究旨在克隆西方蜜蜂Apis mellifera RNA m6A甲基转移酶14 (methyltransferase14,METTL14)基因AmMETTL14,分析AmMETTL14的理化性质和分子特性以及AmMETTL14在工蜂不同发育阶段和不同组织中的表达谱,并制备AmMETTL14多克隆抗体,为持续深入开展AmMETTL14的功能研究提供参考和基础。[方法]通过PCR扩增西方蜜蜂AmMETTL14的CDS并进行Sanger测序验证。使用相关生物信息学软件对AmMETTL14进行生物信息学分析,并构建系统进化树。通过原核表达系统诱导表达AmMETTL14融合蛋白,免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blot分别检测抗体的效价及特异性。采用RT-qPCR检测AmMETTL14在卵、幼虫、预蛹、蛹及工蜂成虫中以及刚出房工蜂成虫的触角、毒腺、脑、中肠、咽下腺、脂肪体和表皮等7种组织中的相对表达量。[结果]成功克隆到西方蜜蜂AmMETTL14的CDS;AmMETTL14的分子式为C1957H3113N567O589S15,分子量约为44.49 kD,脂溶系数为79.97,理论等电点为8.58,平均亲水系数为-0.59,不含典型的跨膜结构域和信号肽,可同时定位于细胞核、线粒体和细胞质;西方蜜蜂、中华蜜蜂A.cerana cerana、黑大蜜蜂A.laboriosa、东方蜜蜂A.cerana、大蜜蜂A.laboriosa、小蜜蜂A.florea、欧洲熊蜂Bombus terrestris、金环胡蜂Ves mandarinia、美洲东部熊蜂B.impatiens和黑腹果蝇Drosophila melanogaster的METTL14均含有MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL14与黑大蜜蜂的METTL14的氨基酸序列一致性最高(65.60%)且亲缘关系最近。制备的AmMETTL14多克隆抗体效价较高(大于512 K)且特异性较强。AmMETTL14在7和8日龄预蛹与卵中的表达量相近且均显著高于在3日龄幼虫中的表达量,在12日龄蛹中的表达量显著高于卵、幼虫和预蛹中的表达量,在6,12和15日龄工蜂成虫体内的表达量显著高于1日龄工蜂成虫体内的表达量;AmMETTL14在刚出房工蜂成虫脑和咽下腺中的表达量与触角中的表达量相近且均显著高于在毒腺、中肠、脂肪体和表皮中的表达量。[结论]研究结果表明,AmMETTL14可能为亲水性、非跨膜和胞内蛋白,AmMETTL3在幼虫生长发育中发挥潜在的调控作用,制备得到的AmMETTL14的多克隆抗体效价高、灵敏度高和特异性强,为进一步探究AmMETTL14的功能及其参与的表观调控机制打下了基础。

关键词：西方蜜蜂 N -甲基腺苷甲基化转移酶14 时空表达谱 MT-A70 抗体

粘虫5-羟色胺7受体的分子和药理学特性分析

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粘虫5-羟色胺7受体的分子和药理学特性分析

作者：郜晓妍河南农业大学

学位级别：硕士

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）是一种单胺类神经递质,在昆虫体内调节许多生理及行为活动,而这些功能是通过与其受体结合实现的,5-HT受体属于G蛋白偶联受体（GPCRs）,此受体被认为是许多杀虫剂潜在的作用靶标。粘虫Mythimna sepa... 详细信息

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）是一种单胺类神经递质,在昆虫体内调节许多生理及行为活动,而这些功能是通过与其受体结合实现的,5-HT受体属于G蛋白偶联受体（GPCRs）,此受体被认为是许多杀虫剂潜在的作用靶标。粘虫Mythimna separata（Lepidoptera:Noctuidae）是我国重要农作物害虫,寄主范围广,又因化学药剂抗药性的产生,导致传统化学杀虫剂难以有效防控粘虫。因此,寻找新型作用靶标基因,以开发新型靶标位点杀虫剂迫在眉睫。5-HT7受体在蜜蜂Apis mellifera和黑腹果蝇Drosophila melanogaster等昆虫中研究较多,但是在粘虫中未见报道。鉴于此本研究根据实验室前期粘虫转录组数据克隆得到5-HT7受体基因序列,通过分子生物学特性分析、时空表达谱的构建以及药理学特性分析,为进一步研究5-HT7受体在粘虫体内的生理功能奠定基础,及评估粘虫5-HT7受体作为新型药剂靶标的潜力,为粘虫新型杀虫剂的开发提供思路。主要研究结果如下:（1）通过PCR技术首次克隆到粘虫体内5-HT7受体基因的两种可变剪接体,分别为粘虫5-HT7受体的长序列和缺失285个核苷酸的短序列,我们将其分别命名为Msep5-HT7L和Msep5-HT7S,并利用生物信息学对两种可变剪接体进行序列分析,通过多序列比对及构建系统发育进化树的方法,确定克隆到的两种可变剪接体属于5-HT7受体家族。（2）利用实时荧光定量PCR（q PCR）技术对粘虫体内5-HT7受体基因进行全时空表达谱的构建,以及分析5-HT7受体基因的两种转录本在粘虫成虫体内相对表达量的差异。结果显示:从不同发育时期来看,5-HT7受体基因表达量从幼虫,蛹至成虫期依次升高,成虫期表达量达到最高峰。从不同发育时期的各组织来看,幼虫期高表达部位主要集中在马氏管和中肠,成虫时期高表达部位主要集中在触角,下唇须,脑三个部位。在成虫高表达部位的触角和下唇须又进行时空表达测定。在触角中,发现雌雄成虫5-HT7受体基因表达量随着日龄增加均无显著变化,但3日龄雄虫表达量显著高于雌虫。而在下唇须中,1日龄雌雄虫5-HT7受体基因表达量显著高于3、5日龄,且1、3日龄的雄成虫表达量显著高于雌成虫。最后以3日龄雌雄成虫各组织为样本,测定Msep5-HT7L和Msep5-HT7S的表达差异,整体呈现出在高表达的触角、下唇须和脑三个部位,5-HT7S表达较多,在低表达的胸、翅、足和腹四个部位,5-HT7L表达较多的趋势。（3）通过真核细胞异源表达技术,获得稳定表达粘虫Msep5-HT7L和Msep5-HT7S受体基因的HEK293细胞系。在此基础上通过ELISA技术进行药理学检测,两个表达有目的受体基因的细胞系均能被5-HT剂量依赖性激活,5-HT可显著诱导细胞内c AMP水平升高。合成激动剂αm-5-HT,5-MT,8-OH-DPAT均能刺激表达有目的受体基因的细胞产生c AMP,但激动效应均比5-HT低,其中αm-5-HT,5-MT对两个细胞系具有较好的激动效应,而8-OH-DPAT激动效应较差。从激动剂对两个细胞系激动效应的差异来看,三个激动剂对Msep5-HT7L的激动效应均大于Msep5-HT7S。在拮抗剂效应测定实验中,五种拮抗剂methiothepin,ketanserin,WAY-100635,SB-258719,SB-269970均能剂量依赖性的抑制5-HT刺激胞内c AMP的产生。综上所述,本研究利用分子克隆技术获得了粘虫5-HT7受体基因两个可变剪接体的c DNA序列,为粘虫5-HT7受体基因的生理功能研究提供了分子基础;利用生物信息学方法分析两个可变剪接体的序列结构及系统发育进化关系,丰富了昆虫5-HT7受体基因的序列信息;利用q PCR技术分析了5-HT7受体基因及两种转录本在粘虫不同发育阶段和组织中的表达模式,为探索5-HT7受体在粘虫体内所行使的生理功能奠定理论基础;最后利用体外HEK293细胞异源表达系统,成功稳定表达了Msep5-HT7L和Msep5-HT7S受体基因,并分析了两者的药理学特性,研究结果有利于构建粘虫5-HT7受体激动剂和拮抗剂筛选技术的体系,也有助于开发以5-HT7受体为靶标的新型杀虫剂。

关键词：粘虫 5-HT7受体基因可变剪接体时空表达谱药理学特性