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国外医学（分子生物学分册） 2002年第1期24卷 29-32页

作者：侯利华童贻刚军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100071

无细胞蛋白合成系统能够以 DNA或 RNA为模板直接在体外合成蛋白 ,通过种种技术改进 ,在某些个例中 ,蛋白表达量已接近体内表达水平 ,并且建立了翻译后修饰和蛋白纯化的方法 ,进一步提高无细胞系统的合成能力。

关键词：无细胞蛋白合成系统转录翻译翻译后修饰研究进展

微环境对无细胞蛋白合成系统的影响和调控研究

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微环境对无细胞蛋白合成系统的影响和调控研究

作者：白丽慧天津大学

学位级别：硕士

细胞微环境能够对细胞内的酶促反应产生重要影响,然而,由于细胞内的环境与反应网络非常复杂,在体内研究微环境对生化反应的影响是非常困难的。而无细胞蛋白合成系统能够在不需活细胞存在的情况下激活蛋白的表达过程,为研究细胞的物化基... 详细信息

细胞微环境能够对细胞内的酶促反应产生重要影响,然而,由于细胞内的环境与反应网络非常复杂,在体内研究微环境对生化反应的影响是非常困难的。而无细胞蛋白合成系统能够在不需活细胞存在的情况下激活蛋白的表达过程,为研究细胞的物化基础提供了一个简便可控的体外模型。本论文围绕微环境对无细胞蛋白合成系统的影响和调控进行一系列研究,主要研究工作归纳如下:在第一章中,我们总结该系统的相关研究进展,并提出本课题的研究意义与研究内容。在第二章中,我们通过质粒提取、细胞提取物以及反应缓冲液的制备,成功建立无细胞蛋白合成系统。在第三章中,我们筛选出四种能够作为拥挤试剂的糖类物质,包括山梨糖、半乳糖、蔗糖和纤维二糖,并且探究拥挤环境对无细胞蛋白合成系统的影响,发现随着这四种糖类物质浓度的升高,系统中m RNA与蛋白的表达量呈现先上升后下降的趋势。针对实验结果我们提出可能的机理解释:在低浓度的糖类物质存在的情况下,由于反应物与拥挤试剂共存于一个有限体积内,反应物的有效浓度增加;当糖类物质的浓度超过临界值后,体系的黏度增加,反应物的扩散受到很大程度的限制。在第四章中,我们利用琼脂糖凝胶模拟细胞内的基质微环境,探究凝胶微环境对分子扩散以及无细胞蛋白合成系统的影响。在最后一章中,我们对本论文进行总结和展望。我们分别利用小分子糖类物质和琼脂糖凝胶模拟细胞微环境,探究微环境对无细胞蛋白合成系统的影响,该研究为生命系统中拥挤效应的研究提供一个新的视角,为体外模拟细胞环境提供一些参考意义,有望为生命起源和生命进化提供启示。

关键词：合成生物学无细胞蛋白合成系统细胞微环境拥挤效应

大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶性表达策略

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大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶性表达策略

作者：张丹萍浙江大学

学位级别：硕士

本文以提高重组蛋白在大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶表达量为目的。首先以hIGF-1为目标蛋白,通过选择合适的策略来提高它在大肠杆菌中的可溶表达量;接着以eGFP为模式蛋白,通过采用富含分子伴侣的大肠杆菌抽提物来提高其在无细... 详细信息

本文以提高重组蛋白在大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶表达量为目的。首先以hIGF-1为目标蛋白,通过选择合适的策略来提高它在大肠杆菌中的可溶表达量;接着以eGFP为模式蛋白,通过采用富含分子伴侣的大肠杆菌抽提物来提高其在无细胞蛋白合成系统中的可溶表达量。我们首先通过RT-PCR的方法从人体肝肿瘤组织中获得目标基因hIGF-1,并构建了表达质粒pET32-hIGF-1,接着分析了不同大肠杆菌宿主BL21 （DE3）, Rosetta （DE3）和Rosetta-gami （DE3）对TrxA-hIGF-1可溶表达的影响。结果表明在大肠杆菌宿主Rosetta-gami （DE3）中,hIGF-1融合蛋白的可溶表达量最高。接着,我们对该重组大肠杆菌Rosetta-gami （DE3）/pET32-hIGF-1的蛋白表达条件进行了系统的优化,在最佳表达条件下,可溶性hIGF-1融合蛋白的表达量达到了最大值2.06 g/L。最后经过细胞破碎,蛋白纯化,肠激酶切割,释放出的成熟hIGF-1浓度达到了0.42 g/L。对于大肠杆菌无细胞蛋白合成系统,本文采用转入分子伴侣质粒的重组大肠杆菌来制备富含分子伴侣的抽提物,并用它来构建无细胞蛋白合成系统。在该富含分子伴侣的无细胞蛋白合成系统中,目标蛋白eGFP的可溶表达量得到了显著提高。本文的研究工作将为提高重组蛋白在体内外的可溶表达量提供行之有效的方法。

关键词： hIGF-1 可溶表达大肠杆菌Rosetta-gami(DE3) 无细胞蛋白合成系统分子伴侣

基于无细胞蛋白合成系统体外合成芋螺毒素μ-PⅢA

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军事医学 2021年第2期45卷 81-84页

作者：梁雅婷李梦姚戈万秀坤蒋辉刘艳丽国民核生化灾害防护国家重点实验室北京102205

目的利用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统(CFPS)体外合成芋螺毒素Mu-conotoxin PⅢA(μ-PⅢA)。方法通过PCR扩增芋螺毒素μ-PⅢA肽前体3种肽段(信号肽、前体肽与成熟肽)不同组合的DNA片段,将其分别克隆到pIVEX-2.4d载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双... 详细信息

目的利用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统(CFPS)体外合成芋螺毒素Mu-conotoxin PⅢA(μ-PⅢA)。方法通过PCR扩增芋螺毒素μ-PⅢA肽前体3种肽段(信号肽、前体肽与成熟肽)不同组合的DNA片段,将其分别克隆到pIVEX-2.4d载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定后得到阳性克隆。在大肠杆菌CFPS体系中加入芋螺毒素μ-PⅢA体外合成所需反应液以及重组表达质粒并开始反应。最后用Western印迹对合成的芋螺毒素μ-PⅢA进行鉴定。结果双酶切和基因测序表明,pI-p3a1、pI-p3a2和pI-p3a3原核表达质粒均构建成功,Western印迹结果表明,通过CFPS体外合成出芋螺毒素μ-PⅢA。结论应用CFPS实现了芋螺毒素μ-PⅢA的可溶性表达,为芋螺毒素翻译后修饰机制研究奠定了实验基础。

关键词：无细胞蛋白合成系统芋螺毒素μ-PⅢA 可溶性翻译后修饰 PⅢA肽前体

人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白的结构改造及其颗粒性抗原的制备

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人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白的结构改造及其颗粒性抗原的制备

作者：杨界第二军医大学

学位级别：硕士

人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及其引起的艾滋病,是我国及全球所面临的重大公共卫生问题,严重危害人类健康。开发研制安全有效的HIV疫苗以及抗HIV药物是控制HIV感染及艾滋病流行的重要措施。 HIV-1反式转录激活因子(trans-activator of tra... 详细信息

人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及其引起的艾滋病,是我国及全球所面临的重大公共卫生问题,严重危害人类健康。开发研制安全有效的HIV疫苗以及抗HIV药物是控制HIV感染及艾滋病流行的重要措施。 HIV-1反式转录激活因子(trans-activator of transcription, Tat)是HIV-1在感染早期产生的一种重要调节蛋白,在病毒复制和感染致病中起重要作用。在HIV感染细胞内,Tat可反式激活病毒基因组转录的起始和延长,从而启动和促进病毒的复制。此外,分泌和释放至细胞外的Tat还具有多样的胞外活性,在艾滋病的免疫抑制、艾滋病脑病和Kaposi肉瘤形成等致病中发挥重要作用,被称为“病毒毒素”,也使得Tat成为HIV疫苗研究的重要候选抗原之一。已有研究表明,尽管天然Tat蛋白的序列在HIV-不同亚型毒株间具有高度的保守性,但其属非折叠蛋白,结构松散,使得天然Tat作为HIV疫苗的候选抗原尚存在诱发抗体尤其是免疫保护性抗体滴度低的问题。因此,本研究根据天然HIV-1Tat分子各功能区特点及其亲疏水性分析,对HIV-1Tat蛋白进行结构改造,原核表达多种截短的Tat突变体蛋白及其与HCV核心蛋白(HCVC)高疏水区122-191aa融合的重组抗原;分别用全长Tat及Tat突变体蛋白制备金标体颗粒,免疫C57BL小鼠进行免疫原性分析;尝试用无细胞体外合成系统制备不同Tat突变体与HCVC122-191融合的重组抗原,并经透射电镜鉴定其颗粒性特征,实验结果将为进一步研究HIV-1Tat生物学功能及制备安全有效的Tat颗粒性免疫原奠定基础。本研究分以下三个部分：第一部分HIV-1Tat突变体与HCV核心蛋白融合重组抗原的原核表达 HIV-1Tat蛋白可分为6个功能区：N端区(1-21aa)、半胱氨酸富集区(22-37aa)、核心区(38-47aa)、碱性氨基酸富集区(48-57aa)、谷氨酰胺富集区(58-72aa)以及C端区(73-101aa))。在我们前期对Tat抗原结构改造及免疫原性分析的基础上,本研究结合对全长Tat蛋白亲疏水性分析结果,首先构建并原核表达了缺失Tat高疏水区(31-45aa)的HIV-1HXB2株Tat突变体融合蛋白PET32a-TatA(31-45)。基本方法和结果如下：以质粒pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)为模板,经PCR和Overlap PCR获得tatΔ(31-45)目的基因片段,构建其原核表达质粒pET32a-TatΔ(31-45),再将该重组表达质粒转入E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,结果获得高表达的截短的Tat突变体融合蛋白PET32a-TatΔ(31-45),其相对分子量约为27,600,其表达量约占菌体总蛋白的55%,明显高于全长Tat和其他Tat突变体蛋白的原核表达量。此外,本研究还利用本实验室前期正确构建保存的不同HIV-1Tat重组表达质粒(pET32a-Tat1-101, pET32a-Tat22-86, pET32a-Tat-22-101, pPEPTIDE2-Tat1-21, pPEPTIDE2-Tat38-61和pPEPTIDE2-Tat60-101),同上经原核表达,分别获得相对应的全长Tat及其突变体融合蛋白,作为本研究中对照及检测用蛋白;用Ni-NTA亲和层析法纯化上述目的融合蛋白。Western blot鉴定结果显示,PET32a-Tat1-101和PET32a-TatΔ(31-45)融合蛋白均与小鼠抗Tat N末端单克隆抗体呈特异性反应,而pET32a载体蛋白则无此反应。在此基础上,选择具有自我组装功能的HCV核心蛋白(HCVC)高疏水区122-191aa为载体,制备不同Tat突变体与HCVC122-191融合的重组抗原。方法是经PCR对编码HCVC122-191基因进行大肠杆菌喜爱密码子优化,以Overlap PCR将tatΔ(31-45)与HCVC(122-191) DNA片段拼接后,克隆至原核表达载体pPEPTIDE2中,构建原核重组表达质粒pPEPTIDE2-TatA(31-45)-HCVC(122-191)0将该重组表达质粒及本室前期构建正确的2种Tat-HCVC重组质粒(pPEP-Tatl-101-HCVC(122-191)和pPEP-Tat22-86-HCVC(122-191))转入*** BL21(DE3)中,经常规IPTG诱导表达(37℃诱导3.5h),用12%SDS-PAGE凝胶电泳检测,结果未获得目的表达条带。随后用低温长时间IPTG诱导方法,即在30℃条件下,在表达菌株E. coli BL21(DE3)中,分别经IPTG诱导10h表达3种Tat-HCVC重组原核表达质粒(pP

关键词： HIV-1Tat蛋白缺失突变 HCV核心蛋白胶体金标记无细胞蛋白合成系统颗粒性抗原

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大肠杆菌无细胞体系合成异源蛋白质的初探

大肠杆菌无细胞体系合成异源蛋白质的初探

作者：汪诚浙江大学

学位级别：硕士

无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统,是一种相对胞内表达系统而言的开放表达系统。它以外源mRNA或DNA为模板,在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质。随着生物组学时代的到来,无细胞蛋白质合成系统显示出快速、方便、易于... 详细信息

无细胞蛋白表达系统又称为体外翻译系统,是一种相对胞内表达系统而言的开放表达系统。它以外源mRNA或DNA为模板,在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质。随着生物组学时代的到来,无细胞蛋白质合成系统显示出快速、方便、易于高通量等优点,因而应用范围不断增加。大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统是一种以外源mRNA或DNA为模板,利用大肠杆菌细胞抽提物的酶系,通过添加氨基酸、T7 RNA聚合酶和能量物质等来表达蛋白质的体外翻译系统。本论文开展大肠杆菌无细胞蛋白合成系统的构建工作,采用正交法对该系统进行优化,提高了大肠杆菌无细胞蛋白合成系统的合成目标蛋白质的能力。构建了6种HIV基因的大肠杆菌无细胞表达载体,并且选取HIV病毒感染因子(Vif)作为目标蛋白,在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统得到了表达,为将来高通量抗HIV药物得筛选奠定了一定的基础。最后,构建了适宜体外表达S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶和5-氨基乙酰丙酸合成酶的表达载体,为将来在无细胞体系中表达具有生物活性的酶开展了探索性工作。

关键词：无细胞蛋白合成系统大肠杆菌 HIV病毒感染因子

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材料辅助优化无细胞蛋白质表达

材料辅助优化无细胞蛋白质表达

作者：孙琦中国石油大学(北京)

学位级别：硕士

随着生物技术的迅速发展,合成生物学已经能够高效的构建各种复杂的生命体系。然而由于合成生物学受到活细胞的影响,使得很多工程研究很难进行。为了解决这些问题,提出了一种新的研究方法:无细胞蛋白合成系统。无细胞蛋白合成系统是一种... 详细信息

随着生物技术的迅速发展,合成生物学已经能够高效的构建各种复杂的生命体系。然而由于合成生物学受到活细胞的影响,使得很多工程研究很难进行。为了解决这些问题,提出了一种新的研究方法:无细胞蛋白合成系统。无细胞蛋白合成系统是一种强大而灵活的研究技术,可以不使用活细胞为生命科学应用设计生物部件。目前无细胞体系被广泛的应用于工业化高通量蛋白质生产的平台技术开发。其中首要的任务就是实现无细胞体系的高产量表达。该任务有一个指导原则就是在无细胞体系中进行细胞质环境模拟,形成大分子拥挤效应。本论文提出利用材料的特性与基因模板相结合在无细胞体系中模拟大分子拥挤环境进而提高蛋白质表达量。首先选择的材料是纳米粘土。纳米粘土作为一种有机-无机混合材料,在与离子溶液混合后会形成具有静电吸引力的水凝胶。利用纳米粘土的吸附效应将质粒固定在其表面,从而在无细胞体系中形成大分子拥挤环境。结果显示它能够将无细胞体系的蛋白质产量提升为原来的1.75倍。接下来使用的材料是热响应水凝胶。热响应水凝胶具有当环境温度达到34℃以上产生体积相变的特性。利用这一特性能够将包裹在水凝胶内部的质粒随着温度的升高释放并聚集在水凝胶表面,形成大分子拥挤环境。结果显示它能够将无细胞体系的蛋白质产量提升为原来的3.7倍。最后使用的材料是金属有机骨架（MOF）。它作为一种有机-无机超分子材料具有稳定包封生物分子的特性。利用这一特性可以对质粒进行包裹并在无细胞体系中构成区室,形成大分子拥挤环境。结果显示它能够将无细胞体系的蛋白质产量提升为原来的2.7倍。另外对于这三种材料参与无细胞反应的动力学进行分析,发现它们可表现出了比原无细胞体系更好的动力学行为,即能够更快速高效的合成蛋白质。对材料参与无细胞反应的转录过程进行分析发现它能够显著的提高转录水平,即材料能够提高无细胞反应的酶转换效率。本论文证实了利用材料固定质粒创造的大分子拥挤环境能够提高基因模板浓度,进而实现无细胞体系的蛋白质高产量表达,为后续无细胞体系的工业化生产平台开发提供了技术支持。

关键词：无细胞蛋白合成系统大分子拥挤纳米粘土水凝胶金属有机骨架