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链霉菌无痕敲除方法研究进展

生物工程学报 2013年第8期29卷 1100-1112页

作者：谷燕燕耿伟涛宋存江南开大学生命科学学院分子微生物与技术教育部重点实验室天津300071

链霉菌是革兰氏阳性放线菌,能产生大量具有重要价值的天然代谢产物。随着基因测序技术、分子生物学和合成生物学的不断发展,人类对链霉菌家族有了更深的了解,从分子水平对其基因组进行改造的手段也越来越多。通过对链霉菌基因组合理、... 详细信息

链霉菌是革兰氏阳性放线菌,能产生大量具有重要价值的天然代谢产物。随着基因测序技术、分子生物学和合成生物学的不断发展,人类对链霉菌家族有了更深的了解,从分子水平对其基因组进行改造的手段也越来越多。通过对链霉菌基因组合理、高效的精简,将提高链霉菌代谢产物的产量和质量,降低底物原料的消耗量。无痕敲除就是开展此项研究工作的重要手段。文章综述了近年来在链霉菌中广泛使用的分子操作方法并重点对链霉菌无痕敲除方法进行了总结。

关键词：链霉菌无痕敲除位点特异性重组归巢核酸内切酶

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大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法

中国生物工程杂志 2014年第6期34卷 68-74页

作者：葛高顺张立超赵昕胡学军李雅杰大连大学医学院大连116622 辽宁出入境检验检疫局大连116001

目的:优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法,提高无痕敲除的效率。方法:以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型,利用Red同源重组系统和核酸内切酶I-SceI的筛选作用,通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,... 详细信息

目的:优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法,提高无痕敲除的效率。方法:以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型,利用Red同源重组系统和核酸内切酶I-SceI的筛选作用,通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,优化无痕敲除时同源DNA长度与诱导用于筛选阳性克隆I-SceI表达的诱导剂浓度。通过比较敲除nanKETA基因前后菌株的生长曲线,研究大肠杆菌CLM37缺失nanKETA基因后的生长状态。结果:成功无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,并在无痕化处理时,通过延长与基因组同源DNA的长度,由通常使用的80碱基对延长到684碱基对;并通过提高诱导筛选基因表达的四环素的浓度,由500μg/ml提高到1000μg/ml后,使无痕敲除效率高达90%以上。生长曲线研究表明,缺失nanKETA基因后的菌株生长状态与原菌株基本一致。结论:通过延长与基因组同源的双链核苷酸的长度和诱导筛选基因表达的四环素的浓度可显著提高无痕敲除的效率。

关键词：大肠杆菌基因组无痕敲除 Red同源重组系统 I-SceI

鸭疫里默氏杆菌RaeE-RaeF-RopN外排泵的鉴定及无痕敲除技术的建立

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鸭疫里默氏杆菌RaeE-RaeF-RopN外排泵的鉴定及无痕敲除技术的建立

作者：王燕萍中国农业科学院

学位级别：硕士

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种属于黄杆菌科、拟杆菌门和里默氏菌属的革兰氏阴性菌,主要侵害2周龄到8周龄的雏鸭,导致雏鸭的浆膜炎。目前养鸭业中常用抗生素防控RA感染,使得多重耐药菌株不断产生并播散,所以亟需... 详细信息

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种属于黄杆菌科、拟杆菌门和里默氏菌属的革兰氏阴性菌,主要侵害2周龄到8周龄的雏鸭,导致雏鸭的浆膜炎。目前养鸭业中常用抗生素防控RA感染,使得多重耐药菌株不断产生并播散,所以亟需对其耐药机制开展研究。至今为止,我们对鸭疫里默氏杆菌的致病机理和耐药机制知之甚少,很大一部分原因是因为缺少高效的遗传操作手段,因此开发新的高效的遗传操作技术也是当前研究的重点方向之一。迄今为止,国内外对于鸭疫里默氏杆菌的外排耐药系统知之甚少。我们根据RA-GD菌株的基因标注,得出在RA-GD菌株中的RIA117-RIA118-RIA119操纵子编码一个假定的三组分RND外排系统,RIA117、RIA118和RIA119基因分别编码外膜蛋白(OMP)、内部膜泵蛋白(泵转运蛋白)和膜周质蛋白(MFP)。在本次研究中,系统鉴定了RIA117、RIA118和RIA119基因的生物学功能。抗生素敏感性试验表明,RIA117、RIA118和RIA119基因的缺失均提高了菌株对阿米卡星、链霉素和SDS的敏感性;通过上述抗菌剂的诱导,使用q RT-PCR检测,RIA117和RIA118基因的转录水平显著上调,但是对于RIA119基因的转录水平未观察到显著差异。CCCP抑制剂检测试验表明RIA117、RIA118和RIA119蛋白利用质子驱动(PMF)介导阿米卡星、链霉素和SDS外排。链霉素累积测定试验证实RIA117、RIA118和RIA119蛋白有助于外排链霉素,而CCCP增加了链霉素在菌体内的积累。此外,RIA117、RIA118和RIA119蛋白也与RA-GD菌株的适应性和毒力有关。这些结果表明,RIA117-RIA118-RIA119操纵子编码一个RND外排系统,该外排系统对链霉素、阿米卡星和SDS具有底物特异性,并与RA-GD的生长和毒力有关。RIA117-RIA118-RIA119被命名为Rae E-Rae F-Rop N外排系统,基于以上结果和结构分析,RIA117、RIA118和RIA119蛋白分别对应于Rop N(OMP)、Rae F(膜泵转运蛋白)和Rae E(MFP)。在本次研究中,利用Erm F基因作为正向标记和sac B基因作为反向标记进行RA-GD菌株中RIA117基因的无痕敲除。通过构建携带RIA117基因上下游同源臂和正反向标记基因的重组自杀质粒p RE112,利用结合转移和同源重组,进行染色体上的第一次敲除,用1μg/m L的红霉素作为选择压力筛选出RIA117基因缺失突变株。然后通过构建携带RIA117基因上下游同源臂的重组自杀质粒对基因缺失株进行第二次敲除,以13%(wt/vol)的蔗糖作为选择压力筛选把sac B-Erm F基因盒缺失掉的菌株。用两步重组法敲除靶标基因并且不留下任何标记,这种无痕敲除技术可以实现对RA-GD菌株基因组中多个靶标基因的连续敲除,为深入研究鸭疫里默氏杆菌的基因功能及其调控机制提供了技术平台。

关键词：鸭疫里默氏杆菌基因缺失菌株基因回补菌株 RND外排系统无痕敲除

脑膜炎奈瑟菌荚膜转换、分子伴侣功能与抗逆性的研究以及细菌基因无痕敲除方法的建立

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脑膜炎奈瑟菌荚膜转换、分子伴侣功能与抗逆性的研究以及细菌基因...

作者：季学猛浙江大学

学位级别：硕士

2013年,浙江省疾控中心报道了一起由X血清群ST-7分离株引起的侵袭性脑膜炎病例。然而,在中国超过50%的侵袭性脑膜炎病是由脑膜炎奈瑟菌A血清群引起;而且,ST-7脑膜炎奈瑟菌株通常属于A血清群。因此,我们推测该次感染是由于发生了荚膜转... 详细信息

2013年,浙江省疾控中心报道了一起由X血清群ST-7分离株引起的侵袭性脑膜炎病例。然而,在中国超过50%的侵袭性脑膜炎病是由脑膜炎奈瑟菌A血清群引起;而且,ST-7脑膜炎奈瑟菌株通常属于A血清群。因此,我们推测该次感染是由于发生了荚膜转换。为了确定该株脑膜炎奈瑟菌是否来源于血清群X菌和ST-7血清群A的英膜转换,我们对X血清群ST-7株菌和3株A血清群菌ST-7的英膜基因座以及它们的侧翼区域进行了测序。通过生物信息学方法分析了英膜转换的基因重组位点,发现该ST-7株替换了来源于X血清群galE至ctrC之间大约8450 bp的DNA片段。同时我们通过荚膜重组体外实验测定了荚膜转换频率和涉及的重组基因片段的大小,结果发现英膜重组的频率大约是6.3×10每细菌每微克DNA,荚膜重组所涉及到的重组基因片段大小约为8.1-9.6kb。脑膜炎奈瑟菌被中性粒细胞吞噬后,中性粒细胞可以产生大量的活性氧族(reactive oxygen species,ROS)以影响细菌生存,同时胞内低pH环境也不利于细菌的生长,但是有研究证明该菌在中性粒细胞中数量呈现先降低后升高的状态。分子伴侣是一类可以协助细胞内其他蛋白质正确折叠的蛋白质,因此,我们推测分子伴侣对于被ROS和低pH损伤的脑膜炎奈瑟菌蛋白质有修复作用,从而有利于细菌在细胞内的存活。我们的实验表明相比野生型脑膜炎奈瑟菌,其分子伴侣突变体对于热、百草枯、过氧化氢、次氯酸和酸性环境更为敏感,暗示分子伴侣对于脑膜炎奈瑟菌的致病性有重要影响。在对脑膜炎奈瑟菌分子伴侣的研究中,我们开发出一种新型的基因无痕敲除方法。这一方法组合使用抑菌型抗生素和杀菌型抗生素提高反向筛选的效率。该方法同时适应于另一革兰阳性李斯特菌,说明该方法可能适用于革兰阳性和革兰阴性细菌基因敲除。

关键词：脑膜炎奈瑟菌脑膜炎英膜转换分子伴侣无痕敲除

大肠杆菌必需基因的CRISPR-Cas9敲除策略及高效质粒置换方法

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食品与发酵工业 2023年第18期49卷 17-23页

作者：刘锦辉黄建峰尤晓颜张燕飞河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023 中国科学院天津工业生物技术研究所国家合成生物学技术创新中心天津300308

由于必需基因的功能必须性使其难以从基因组上被删除,而此前报道的方法存在效率低、非无痕敲除等缺点。基于此,该文建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组必需基因高效无痕敲除方法。以大肠杆菌metK基因(编码S-腺苷甲硫氨酸合酶)为例,首先... 详细信息

由于必需基因的功能必须性使其难以从基因组上被删除,而此前报道的方法存在效率低、非无痕敲除等缺点。基于此,该文建立了一种基于CRISPR/Cas9的基因组必需基因高效无痕敲除方法。以大肠杆菌metK基因(编码S-腺苷甲硫氨酸合酶)为例,首先将metK基因克隆至质粒pTarget-metK,并采用定点突变方式将metK基因进行同义突变移除对应的PAM序列,构建获得质粒pHL3。进一步构建含有与pHL3相同metK的回补质粒,pCas、pHL3及回补质粒依次转化即可完成基因组必需基因的高效无痕敲除。该方法对必需基因metK编辑时编辑效率可达100%。为了研究必需基因的酶学性质改变对宿主代谢的影响,探索了基于质粒不相容及Flp/FRT系统对回补质粒的置换效率,发现基于Flp/FRT系统可实现回补质粒高效置换。生长测试表明携带metK野生型或是PAM位点突变的metK编辑菌株与野生型菌株在LB培养基和M9培养基中生长无明显差异,而对L-甲硫氨酸亲和力下降MetK突变体则表现明显的生长延滞。

关键词：必需基因 CRISPR/Cas9 基因编辑质粒置换无痕敲除

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多聚磷酸盐激酶基因在污水生物除磷中的功能

环境科学 2017年第4期38卷 1529-1535页

作者：南亚萍周国标袁林江西安建筑科技大学环境与市政工程学院西安710055

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk^-Kan^+... 详细信息

为验证多聚磷酸盐激酶基因(ppk)在污水生物除磷中的功能.采用Red敲除系统,以p KD4质粒为模板,设计同源短臂,扩增外源线性DNA片段,将外源线性DNA片段电转化整合入已导入p KD46的大肠杆菌ATCC25922野生型菌株.获得重组菌E.coli/ppk^-Kan^+.将p CP20导入大肠杆菌E.coli/ppk^-Kan^+以消除卡那霉素抗性基因,通过负抗性筛选及正反向引物验证,构建无抗生素抗性的ppk基因缺失工程菌株E.coli/ppk^-Kan^-.比较工程菌株和野生型菌株的生长特性,并比较两者在缺磷诱导/富磷及多次厌氧/好氧诱导条件下的除磷性能.结果表明采用Red重组系统,通过无痕敲除,成功构建了大肠杆菌ppk基因缺失菌株E.coli/ppk^-Kan^-.敲除后的工程菌株和野生型菌株生长整体没有差异,但是4 h前对数期工程菌株生长快于野生型菌株,8 h后稳定期工程菌株生长慢于野生型菌株,表明ppk影响菌体的生长;缺磷诱导/富磷条件下,工程菌株并未表现出因ppk缺失而影响其除磷能力;经过5次厌氧/好氧诱导,两菌菌体含磷量保持在1%~2%,没有因诱导次数的增加而表现出菌体含磷量增加的趋势,也未发现厌氧有PHB好氧有聚磷颗粒生成,表明ppk基因的缺失并没有引起菌体除磷能力的下降.ppk并未表现出明显的与污水生物除磷相关的功能.

关键词：污水生物除磷大肠杆菌无痕敲除多聚磷酸盐激酶除磷性能

谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除方法学的研究

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谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除方法学的研究

作者：吴梦南京师范大学

学位级别：硕士

基因敲除是阐明基因功能与构建高效微生物细胞工厂的重要手段。谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是工业上重要的用于生产氨基酸及其衍生物的菌株。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032（C.glutamicum ATCC 13032）为模式菌株,对该菌... 详细信息

基因敲除是阐明基因功能与构建高效微生物细胞工厂的重要手段。谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是工业上重要的用于生产氨基酸及其衍生物的菌株。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032（C.glutamicum ATCC 13032）为模式菌株,对该菌株基因组的修饰将有助于研究基因表征,蛋白质功能,并有助于提高氨基酸的产量及优化氨基酸的生产工艺。R6K复制子的复制需要一种特殊的Pir蛋白,大多数细菌不产生这种蛋白质,因此R6K复制子广泛地用于自杀质粒的构建。自杀质粒转化至寄主细胞后须整合到染色体上与染色体一同复制。根据这个特点,可以利用目标敲除基因两端的同源片段,定位自杀质粒的整合位点,从而构建精确的基因缺失菌株。目前对于C.glutamicum ATCC 13032的基因改造策略仍存在操作繁琐及效率低等缺点。为研究此问题,本研究组此前利用自杀质粒与I-SceI联合介导的基因工程策略得到了一系列将自杀质粒整合至C.glutamicum ATCC 13032染色体基因组上的整合菌株。本文第一部分首先对于这些整合菌株进行自杀质粒的消除。随后对C.glutamicum ATCC 13032基因组中的2个前噬菌体即CGP2和CGP3进行敲除。具体方法为构建自杀质粒pLS3730和pLS3732,分别转入C.glutamicum ATCC 13032,获得具有卡那霉素抗性的整合菌株,随后在含1 mM IPTG的液体培养基中进行培养,IPTG诱导归巢核酸内切酶I-SceI表达,通过酶切整合菌株染色体上的I-SceI酶切位点造成菌株染色体DNA的双链断裂,菌株在自身的修复机制下进行同源重组,得到crtI2、crt操纵元、CGP1、CGP2的无痕敲除菌株。实验结果表明,基因敲除的效率均高于50%,最高达到90%。在以自杀质粒进行前噬菌体CGP3的基因敲除实验发现,用此方法只得到将自杀质粒整合至基因组的菌株,并未得到正确的敲除菌株。推测可能是由于CGP3长达180kb而不利于双链断裂修复的进行。为探索高效敲除C.glutamicum ATCC 13032基因组中CGP3的方法,本研究第二部分分别通过基于质粒水平和基因组水平联合重组工程和I-SceI的方法对CGP3进行敲除。重组工程,即重组介导的基因工程,也称作λ-Red/ET同源重组,是一种通过表达重组酶来催化DNA分子之间进行同源重组而实现DNA修饰的一种基因工程手段。其中发挥作用的重组酶,主要是由λ噬菌体中redαβ基因表达的蛋白或由大肠杆菌Rac前噬菌体中的recET基因表达的蛋白。重组工程的突出优点在于该技术实验过程操作简单,不受DNA分子大小及限制性内切酶酶切位点的限制,避免了其他基因敲除方法中需要反复构建克隆的步骤,直接通过PCR或OE-PCR即可获得重组片段,实现对基因组的精准修饰。重组工程和I-SceI联合介导的基因敲除,具体方法为构建含有CGP3敲除的打靶DNA片段的质粒pLS4121,以及表达重组酶及归巢核酸内切酶I-SceI不同诱导体系的质粒 pLS3635、pLS4132、pLS4133、pLS4136、pLS4137。将质粒分别转入C.glutamicum ATCC 13032中,得到含有能够诱导表达重组酶质粒的菌株。构建能够将诱导表达重组酶及I-SceI的DNA元件整合至基因组的质粒pLS4141,将其转入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中得到基因组水平表达重组酶及I-SceI的菌株LS4129。再向这些菌株中转入打靶DNA片段,通过抗性筛选获得打靶DNA片段整合至基因组上的菌株,利用不同的诱导体系诱导表达I-SceI,最终得到CGP3无痕敲除菌株。结果显示利用由IPTG诱导表达重组酶基因recET,L-阿拉伯糖诱导表达密码子修饰的I-SceI的质粒pLS4132敲除CGP3的效率最高,且打靶DNA片段上的同源臂长度达到1 kb时敲除效果最佳。本研究虽然能够实现基因敲除,但目前的基因敲除效率仍然较低,后续的实验将优化各条件以提高其效率。

关键词：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 自杀质粒重组工程 I-SceI 基因组修饰无痕敲除

嗜酸性喜温硫杆菌中硫氰酸酶的性质鉴定和基因敲除

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嗜酸性喜温硫杆菌中硫氰酸酶的性质鉴定和基因敲除

作者：张成家山东大学

学位级别：硕士

嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)是一种中度嗜热嗜酸化能自养革兰氏阴性硫氧化细菌,能够氧化还原型无机硫化合物以获得生长所需的能量。嗜酸性喜温硫杆菌在生物浸矿过程中发挥着重要作用,但是由于其生长速率慢,有机质敏感,... 详细信息

嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)是一种中度嗜热嗜酸化能自养革兰氏阴性硫氧化细菌,能够氧化还原型无机硫化合物以获得生长所需的能量。嗜酸性喜温硫杆菌在生物浸矿过程中发挥着重要作用,但是由于其生长速率慢,有机质敏感,嗜酸性环境,硫代谢系统复杂等不利因素的影响,使得对嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢的研究进展缓慢。硫氰酸酶是一种硫代硫酸盐硫转移酶,广泛存在于各种生物体的各种代谢过程中。虽然已经发现了七十余年,由于其生物学底物不是很清楚,所以其功能仍然备受争议。在嗜酸性喜温硫杆菌A. caldus MTH-04基因组中发现四个硫氰酸酶基因,其中rhd2475所在的基因簇在其他嗜酸性喜温硫杆菌菌株以及氧化亚铁嗜酸硫杆菌中通过组学方法被证明可能参与硫代谢过程。为更好地阐述硫氰酸酶在嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢过程中的作用,本论文通过异源表达并纯化得到硫氰酸酶,鉴定其酶学性质。同时通过基因敲除的方法对硫氰酸酶的作用进行研究。首先通过启动子分析以及反转录PCR实验讨论了硫氰酸酶基因敲除的可行性,而后构建置换敲除自杀质粒pRE-rhd,利用接合转移的方法在卡那霉素抗性平板上筛选敲除菌株,结果发现得到的57株菌株全部为单交换菌株,可能由于硫氰酸酶为必需基因,敲除造成致死突变。因而构建了I-Sce Ⅰ的表达及硫氰酸酶回补质粒pIS-rhd,并且在置换敲除自杀质粒pRE-rhd的基础上,加入归位内切酶I-Sce Ⅰ识别位点,构建了无痕敲除自杀质粒pML-rhd。通过接合转移的方法利用抗生素筛选得到单交换菌株,将质粒pIS-rhd导入单交换菌株中,胞内表达产生的l-Sce Ⅰ识别整合到染色体上的特异性位点,并切割后诱发细胞内的重组修复机制,从而增加同源重组的概率并得到无痕敲除菌株。在挑取的150个菌落中筛选得到了3个突变菌和7株野生菌,对嗜酸性喜温硫杆菌中必需基因的无痕敲除进行了探索。

关键词：硫氰酸酶无痕敲除 I-Sce Ⅰ 必需基因嗜酸性喜温硫杆菌

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链霉菌负调控因子突变筛选系统的构建

微生物学报 2013年第10期53卷 1031-1042页

作者：朱宇冯迟谭华荣田宇清中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院大学北京100049

【目的】构建用于阻遏链霉菌隐性次级代谢基因簇表达的负调控因子筛选的报告系统。【方法】通过"REDIRECT(Rapid Efficient Directed Recombination Time Saving)"技术结合链霉菌温和噬菌体BT1整合酶的体内位点特异性重组技术,对链霉... 详细信息

【目的】构建用于阻遏链霉菌隐性次级代谢基因簇表达的负调控因子筛选的报告系统。【方法】通过"REDIRECT(Rapid Efficient Directed Recombination Time Saving)"技术结合链霉菌温和噬菌体BT1整合酶的体内位点特异性重组技术,对链霉菌中多基因进行无痕敲除。以链霉菌隐性次级代谢基因簇中受阻遏的启动子驱动链霉菌中保守的inoA构建报告质粒,针对阻遏次级代谢基因簇表达的负调控基因的突变进行检测,以验证报告系统的可行性。【结果】本研究首先通过对天蓝色链霉菌的肌醇从头合成途径关键酶基因inoA,及合成黄色聚酮类隐性抗生素(yellow cryptic polyketide,yCPK)的途径特异性负调控基因scbR2依次进行了无痕敲除,以构建进一步筛选所用的受体菌,再以scbR2阻遏的cpkO启动子控制inoA的表达构建了报告质粒pIJ8660::P cpkO::inoA。结果显示沉默的cpkO启动子在突变的受体菌中被激活并使inoA得到了表达,可以使inoA的光秃型突变表型在不添加肌醇的培养基上恢复到产孢的野生型表型。【结论】inoA可以作为新的链霉菌普遍适用的报告基因,可方便地通过表型变化的观察进行筛选,同时可针对性对负调控基因的突变进行检测,可应用于链霉菌隐性抗生素激活的研究。

关键词：链霉菌 inoA 报告基因无痕敲除隐性基因簇