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芴基阳离子聚电解质及其无标记生物分子检测

芴基阳离子聚电解质及其无标记生物分子检测

作者：郝疏影南京邮电大学

学位级别：硕士

虽然现代科技文明发展带来人类的医疗技术的极大提升和发展，但是面对众多难以攻克的疾病问题，人们的应对手段依然匮乏，例如艾滋病、癌症、基因病变和还在源源不断产生的新的病毒等等。近年来，生物传感技术作为生物医学科技的研究基... 详细信息

虽然现代科技文明发展带来人类的医疗技术的极大提升和发展，但是面对众多难以攻克的疾病问题，人们的应对手段依然匮乏，例如艾滋病、癌症、基因病变和还在源源不断产生的新的病毒等等。近年来，生物传感技术作为生物医学科技的研究基础，得到了人们的热切关注和长足发展。水溶性共轭聚合物，也称共轭聚电解质，因其共轭主链的信号放大特性、水溶性基团赋予的良好水溶性而广泛应用于生物传感技术中。目前基于共轭聚电解质的生物传感器工作机制分别为电子转移（Electron Transfering, ET）、荧光共振能量转移(Fluorescent ResonanceEnergy Transfering, FRET)和分析物诱导的聚集或构象变化等。其中，基于分析物诱导的聚集的共轭聚合物传感方法报道较少、研究价值挖掘的不够充分。而其他两种机理的传感应用中，大部分都需要对生物分子或者检测靶标进行标记，标记的过程复杂且昂贵，非常不利于其商业应用。综上所述，基于分析物诱导的聚集机理，本文选择构建一种含有2,1,3-苯并噻二唑单元的阳离子芴基聚电解质（下文统一称为P4），研究其光学性质和对于生物大分子的无标记检测应用。主要内容有下面几个方面：第一、根据文献报道，设计P4的骨架结构，并成功合成出P4。第二、研究体系中P4与带负电荷的不同浓度十二烷基磺酸钠（SDS）的相互作用，并推出合理的三种聚集过渡状态的模型。第三、对P4在生物大分子检测方面的应用做了研究，建立了基于P4的生物大分子分析检测应用平台。首先，在DNA检测方面，实现了单链DNA的定量检测，并且可以结合互补链DNA实现DNA的特异性检测;其次，在蛋白质检测方面，可以实现癌症标记物蛋白的初步筛选，这对癌症初诊具有重大的意义;另外也可以结合三磷酸腺苷（ATP）实现碱性磷酸酶（ALP）的特异性检测。第四、研究了P4、金纳米粒子（Gold Nano-particals,Au NPs）或巯基包裹的金纳米粒子、DNA三元体系的相互作用;为开展基于P4/Au NPs有机-无机杂化复合传感器的应用奠定基础。

关键词：共轭聚电解质生物传感无标记检测分析物诱导聚集

检测K-ras G12D点突变的灵敏、无酶、无标记电化学传感器的研究

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检测K-ras G12D点突变的灵敏、无酶、无标记电化学传感器的研究

作者：周晓梅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:K-ras基因是表皮生长因子受体(EGFR)信号通路中最常发生突变的基因,其中最常见的突变类型是K-ras G12D点突变(K-ras G12DM)。K-ras基因的突变状态被认为是结直肠癌患者早期诊断和靶向药物疗效评估的关键性指标。考虑到现有检测手... 详细信息

目的:K-ras基因是表皮生长因子受体(EGFR)信号通路中最常发生突变的基因,其中最常见的突变类型是K-ras G12D点突变(K-ras G12DM)。K-ras基因的突变状态被认为是结直肠癌患者早期诊断和靶向药物疗效评估的关键性指标。考虑到现有检测手段存在的一些缺陷,如灵敏度和特异性有限、操作程序复杂、仪器设备昂贵等,本研究拟构建一种灵敏、高效的电化学传感器用于低丰度突变标志物的检测,为相关疾病的诊疗提供了有力的工具。方法:1.金电极的表面修饰:将TCEP还原的捕获探针(H)修饰在电极表面,然后用封闭剂(MCH)覆盖电极表面的非特异性位点。2.液相循环扩增体系的建立:首先,将反应链(S,S)与靶DNA混合,形成完整的DNAzyme活性结构。随后,将DNAzyme酶切底物链(H)与杂交反应链(H,H)依次加入上述混合液中进行扩增反应。DNAzyme酶切这一循环过程被琼脂糖凝胶电泳验证。3.电化学传感器的构建及信号检测:将液相扩增体系转移到修饰的金电极表面激活杂交链反应,电活性指示剂亚甲蓝(MB)插入杂交双链而产生电化学信号。传感器的构建过程通过电化学阻抗法(EIS)和循环伏安法(CV)进行验证。优化实验条件后,利用差分脉冲伏安法(DPV)对不同浓度的K-ras G12DM进行电化学检测并绘制标准曲线。4.传感器性能评估:包括灵敏度、特异性、稳定性及回收率实验。结果:1.DNAzyme的循环酶切过程通过琼脂糖凝胶电泳得到了验证。2.电化学阻抗法和循环伏安法验证了传感器的逐层组装过程,表明电化学传感器成功构建。3.在固定最优的实验参数后,电化学信号与靶DNA浓度的对数值呈线性相关,检测范围是0.5 fM-50 nM,线性方程为I(μA)=2.75928lg c(pM)+14.2228(R=0.99348)。4.该传感器性能良好,检测限低至0.5 fM,具有较好的特异性和重复性,回收率结果也比较满意。结论:通过整合DNAzyme和HCR两种信号放大机制,成功构建了一种灵敏高效的电化学传感策略用于低浓度K-ras G12D点突变的检测,且重复性、特异性及回收率结果都令人满意。此外,该传感策略无需蛋白酶、无需标记,成本低廉,具有较高的临床应用潜力。

关键词：电化学传感器双重级联放大无酶无标记检测 K-ras G12D点突变

基于表面印迹聚合物的电化学传感器用于乙型副伤寒沙门氏菌的检测

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分析化学 2022年第1期50卷 127-135页

作者：刘婷林晓惠陈谦卞晓军颜娟上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)

致病菌感染引发的食源性疾病已成为全球性的食品安全和公共卫生问题，因此，构建快速、灵敏的致病菌分析方法具有重要意义。本研究结合分子印迹技术与电化学阻抗技术，以噻吩-3-乙醇(TE)为单体，乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B)为模... 详细信息

致病菌感染引发的食源性疾病已成为全球性的食品安全和公共卫生问题，因此，构建快速、灵敏的致病菌分析方法具有重要意义。本研究结合分子印迹技术与电化学阻抗技术，以噻吩-3-乙醇(TE)为单体，乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B)为模板，采用一步电聚合法在玻碳电极表面快速、便捷地制备了一层具有特异性识别能力的细菌印迹膜，据此构建了一种快速、灵敏、无标记检测沙门氏菌的新方法。采用电化学阻抗和扫描电子显微镜对细菌印迹膜的形成过程进行了表征。在最佳实验条件下，细菌印迹传感器具有识别快速(仅10 min)、线性范围宽(1.0×10~1～1.0×10~6 CFU/mL)、检出限低(约2.0 CFU/mL)、选择性好等良好的分析性能，用于实际样品(饮用水和脱脂奶粉)中沙门氏菌的检测效果良好，回收率高(93.0%～114.9%)。与现有的细菌生物传感方法相比，此传感器具有制备高效(印迹膜的形成仅需15 min)、成本低、环境友好等优点，在细菌检测方面具有较大的应用潜力。

关键词：乙型副伤寒沙门氏菌电化学聚合表面印迹聚合物聚噻吩细菌电化学传感器细菌印迹无标记检测

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活体流式细胞术的研究和应用

中国生物工程杂志 2023年第12期43卷 14-23页

作者：刘玥萌董司翰魏勋斌北京大学医学部医学技术研究院北京100191

流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种经典的单细胞分析技术,可快速定量分析处于快速直线流动中的细胞或生物颗粒的多参数特征,并同时进行分选,具有重要的生物医学应用价值。基于荧光的传统FCM发展了近五十年,技术已逐渐成熟。然而,传... 详细信息

流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种经典的单细胞分析技术,可快速定量分析处于快速直线流动中的细胞或生物颗粒的多参数特征,并同时进行分选,具有重要的生物医学应用价值。基于荧光的传统FCM发展了近五十年,技术已逐渐成熟。然而,传统的FCM需要侵入式地从生物体中抽血取样,会扰乱生物体自身的生理环境并限制实时检测。活体流式细胞术(in vivo flow cytometry,IVFC)作为一种新兴的技术,可实现对于活体内细胞样本的无创检测。基于荧光激发、光声效应、光热效应等原理,已开发出一系列多种功能的IVFC。通过回顾不同类型IVFC的发展脉络和基本原理,对比分析其基本参数,并综述基于IVFC的循环肿瘤细胞的研究发现和新型无标记检测的最新研究成果,有助于进一步理解IVFC的发展趋势和应用前景。

关键词：活体流式细胞术循环肿瘤细胞无标记检测

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细菌印迹电化学传感用于沙门氏菌的快速检测

细菌印迹电化学传感用于沙门氏菌的快速检测

作者：刘婷上海海洋大学

学位级别：硕士

根据欧洲疾病预防和控制中心(European Center of Disease Prevention and Control,ECDC)和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告,沙门氏菌是引发全球细菌食源性感染的第二大致病菌,且全球每年约有13亿例由沙门氏菌感染引... 详细信息

根据欧洲疾病预防和控制中心(European Center of Disease Prevention and Control,ECDC)和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告,沙门氏菌是引发全球细菌食源性感染的第二大致病菌,且全球每年约有13亿例由沙门氏菌感染引发的急性胃肠炎/腹泻,导致约300万人死亡。由于沙门氏菌感染限量低、病程进展快,严重威胁人类健康和公共卫生,因而迫切需要发展一种灵敏快速的沙门氏菌检测方法。基于分子印迹聚合物的电化学传感已被广泛应用于有机小分子的检测,但在细菌检测方面应用尚少且面临着一些挑战。一方面,细菌尺寸大,在聚合物中嵌入较深,模板去除困难。此外,较深的空穴使得模板细菌难以与识别位点结合。另一方面,细菌表面化学组成非常复杂,设计合适的功能单体面临挑战。鉴于细菌表面存在一些官能团(如羟基、羧基、酰胺基、磷酰基等),本论文选择可与其产生氢键作用的物质作为单体,采用电化学聚合这一表面印迹策略,在电极表面原位制备细菌印迹膜,通过改变聚合条件控制印迹膜的厚度,从而实现模板的快速洗脱和细菌的快速识别。主要内容如下:首先,选择3-噻吩-乙醇(TE)为功能单体,以乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B)为模板细菌,通过循环伏安法(CV)在玻碳电极(GCE)表面原位制备细菌印迹膜。该薄膜结构新颖,无腔状印迹位点,进而实现了对沙门氏菌的快速捕获。采用CV、电化学阻抗谱(EIS)、扫描电子显微镜(SEM)及原子力显微镜(AFM)对细菌印迹膜的制备过程及形貌进行表征。为获得最佳的传感性能,对印迹膜的制备及识别条件进行优化。在最佳实验条件下,传感器的线性范围宽至6个数量级(10～10CFU/m L),检测限低至2.0 CFU/m L。此外,该传感器具备良好的选择性、重现性以及一定程度的再生性。并成功用于饮用水和奶粉中沙门氏菌的快速检测,取得了理想的回收率(93%～104.9%)。其次,采用恒定电量法制备细菌印迹膜,通过对聚合电位、聚合电量、电解质p H以及电解液离子浓度等四个影响电聚合的因素进行优化,得到最佳实验条件。然后比较四种噻吩类功能单体:3-噻吩甲胺(TA)、3-噻吩硼酸(TBA)、3-噻吩乙酸(TAA)、3-噻吩乙醇(TE)的细菌印迹效果。结果显示,这四种单体均可作为制备细菌印迹膜的理想单体且TE的印迹效果更佳。另外,在相同的聚合条件下,不同的侧链取代基与细菌表面的结合能力不同,进而导致细菌印迹的识别效率和非特异性吸附不同,以此说明选择合适的功能单体对于细菌印迹膜的制备具有重要意义。最后,对细菌印迹的化学识别机理进行初步探索。分别采用乙二胺四乙酸(EDTA)和阳离子聚合物—聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)处理细菌,破坏其表面结构或改变细菌的表面电荷。结果显示,一定浓度的EDTA和PDDA对细菌印迹的识别效率具有显著的抑制作用,且随着浓度的增加/孵育时间的延长,抑制效果变强。进而推断O-抗原与静电相互作用在细菌印迹的化学识别过程中起着十分重要的作用。最后,在上述工作的基础上,提出了一种基于金属有机框架结构(Metal-Organic Frame structure,MOFs)组装材料和DNA水凝胶的两种方法来进行信号放大。(1)在金属有机框架(MOFs)载体上原位制备纳米金颗粒(Au NPs),通过Au-S键将沙门氏菌适配体组装到复合材料表面,形成识别材料,进而构建一种夹心式的电化学传感器。由于所合成的MOFs材料具备过氧化物酶活性,可催化氧化含HO的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)。通过计算S.Paratyphi B浓度与由此产生的TMB/HO的DPV电流响应实现对S.Paratyphi B的检测。(2)尝试以细菌印迹为基底,利用引物和两条部分互补的环模板通过滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)形成数十乃至数百条双链,原位制备DNA水凝胶。亚甲基蓝(MB)作为一种染料可通过静电吸附和插层结合嵌入DNA双链,由于本身具有氧化还原活性,电子沿着DNA双链穿梭产生强烈的电流响应,从而实现标记策略。遗憾的是,两种标记策略均处于初步探索阶段,后续课题组将进一步开展相关工作。

关键词：电化学传感细菌印迹沙门氏菌导电聚合物无标记检测

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便携式定量相位显微成像系统设计

激光与光电子学进展 2023年第22期60卷 185-194页

作者：赵英然闫克丁李佳一马岩西安培华学院智能科学与信息工程学院陕西西安710125 西安工业大学电子信息工程学院陕西西安710021 西南石油大学电气信息学院四川成都610500

为实现无标记样本的定量检测,借助NX12.0搭配相关器件自主设计了一款小型化相位显微镜。相较于市面上售价高昂的相位显微镜,所设计显微镜无需相干器件,且在满足系统分辨率的前提下,将体积缩小了约60%,大幅提高了便携性,同时成本仅需500... 详细信息

为实现无标记样本的定量检测,借助NX12.0搭配相关器件自主设计了一款小型化相位显微镜。相较于市面上售价高昂的相位显微镜,所设计显微镜无需相干器件,且在满足系统分辨率的前提下,将体积缩小了约60%,大幅提高了便携性,同时成本仅需5000元左右。系统中还嵌入了自动对焦算法和基于变换域的视场校正算法,以加快检测速度和相位恢复的准确率。经测试,系统在10倍物镜下的分辨率达到了分辨率板极限2.19μm,同时随机相位板的检测表明相位恢复的准确率也达到了基本需求。除此之外,还对活细胞结构和平面玻璃的缺陷进行了测试。结果表明,所提系统不仅能对活细胞进行较好的定量测量,还可以在透明/半透明平面缺陷的检测中发挥重要作用,更是证明了这种成本低、便携性高、可实现无标记样本定量的系统设计方案的可行性。

关键词：成像系统相位显微镜无标记检测活细胞定量测量平面缺陷检测 3D光固化技术

基于金纳米线构建电化学传感器间接检测碱性磷酸酶活性

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上海师范大学学报（自然科学版） 2022年第5期51卷 582-589页

作者：余婷婷王敏文颖杨海峰上海师范大学化学与材料科学学院上海200234

在临床实践中,碱性磷酸酶(ALP)是最常检测的酶之一,已被广泛用作肝病、骨病、乳腺癌、前列腺癌以及糖尿病等多种疾病的重要检测指标.通过自组装方法在氧化铟锡(ITO)导电玻璃上制备金纳米线(AuNWs),利用4-巯基苯甲酸(4-MBA)修饰AuNWs,对... 详细信息

在临床实践中,碱性磷酸酶(ALP)是最常检测的酶之一,已被广泛用作肝病、骨病、乳腺癌、前列腺癌以及糖尿病等多种疾病的重要检测指标.通过自组装方法在氧化铟锡(ITO)导电玻璃上制备金纳米线(AuNWs),利用4-巯基苯甲酸(4-MBA)修饰AuNWs,对其进行改性,与铜离子(Cu^(2+))螯合形成Cu^(2+)-AuNWs/ITO电极.在ALP活性检测中,电解液中的焦磷酸根阴离子(PPi)与电极表面Cu^(2+)结合,湮灭了Cu^(2+)的电化学信号.ALP的加入使底物PPi水解并释放出Cu^(2+),电化学信号增加.构建的Cu^(2+)-AuNWs/ITO电极对ALP活性检测范围为60~180 U·L^(-1),且抗干扰性能良好.

关键词：碱性磷酸酶(ALP) 金纳米线(AuNWs) 无标记检测电化学传感器

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基于微流控的现代生物医学检测技术概述

应用化工 2018年第6期47卷 1227-1231页

作者：成一诺陈子浩李锦帆清华大学精密仪器与机械学系北京100084 夷陵中学湖北宜昌443000

首先介绍了微泵和微阀等常用的微流控器件,然后介绍了利用微流控技术进行片上预处理的方法,包括细胞分离、细胞裂解和微流控富集技术。最后,对微流控在免疫检测中的应用进行了介绍。现代医学检测需要一种全自动、集成化、低成本并且易... 详细信息

首先介绍了微泵和微阀等常用的微流控器件,然后介绍了利用微流控技术进行片上预处理的方法,包括细胞分离、细胞裂解和微流控富集技术。最后,对微流控在免疫检测中的应用进行了介绍。现代医学检测需要一种全自动、集成化、低成本并且易于操作的微流控系统,从这些方面考虑,给出了微流控生物芯片的一些改进方向。

关键词：微流控生物医学检测免疫检测预处理富集无标记检测

光学表面等离子共振生物传感器检测脱落酸的试验研究

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河南农业大学学报 2014年第1期48卷 75-79页

作者：穆琳瑛王满苹王顺王婷婷曹百穹孙晓辉朱娟花胡建东河南农业大学机电工程学院河南郑州450002 河南农大迅捷测试技术有限公司河南郑州450002

采用便携式光学表面等离子共振生物传感器快速检测植物激素脱落酸.建立了一种新颖、无标记和检测脱落酸抗体和抗原特异性结合反应的方法.在光学表面等离子共振生物传感器的传感芯片表面固定脱落酸抗原用以制备生物分子识别膜,采用间接... 详细信息

采用便携式光学表面等离子共振生物传感器快速检测植物激素脱落酸.建立了一种新颖、无标记和检测脱落酸抗体和抗原特异性结合反应的方法.在光学表面等离子共振生物传感器的传感芯片表面固定脱落酸抗原用以制备生物分子识别膜,采用间接抑制法快速检测脱落酸.采用0,25,50,200,500,1 000 mg·L-1的脱落酸实际样品进行检测.结果表明,光学表面等离子共振响应信号与脱落酸含量之间呈良好的线性关系,相关系数为-0.998,相对偏差为4.13%.

关键词：植物激素脱落酸光学表面等离子共振分子识别膜生物传感器无标记检测