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NGPV感染DEF细胞对cGAS-STING信号途径的影响研究

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NGPV感染DEF细胞对cGAS-STING信号途径的影响研究

作者：邓志超仲恺农业工程学院

学位级别：硕士

2015年来我国许多地区陆续分离到以感染番鸭、樱桃谷鸭、麻鸭为主的新型鹅细小病毒(NGPV),NGPV感染造成以短喙、舌头外伸和生长严重受阻为特点的短喙侏儒综合征(Short Beak and Dwarfism Syndrome,SBDS),NGPV很难被宿主细胞清除且能垂... 详细信息

2015年来我国许多地区陆续分离到以感染番鸭、樱桃谷鸭、麻鸭为主的新型鹅细小病毒(NGPV),NGPV感染造成以短喙、舌头外伸和生长严重受阻为特点的短喙侏儒综合征(Short Beak and Dwarfism Syndrome,SBDS),NGPV很难被宿主细胞清除且能垂直传播,感染后造成的死亡率较低,但对我国水禽养殖业造成了较大的经济损失。为此本研究拟从病毒感染和病毒蛋白表达两个层面研究NGPV对DEF细胞cGAS-STING信号途径的影响,为研究NGPV的防治和免疫逃逸的机制提供理论基础。本研究通过病毒感染鸭胚成纤维细胞,研究了NGPV在鸭胚成纤维细胞内增殖情况和对cGAS-STING信号途径的影响。首先,以MOI=1的NGPV感染DEF细胞,检测感染后6～96 h的病毒DNA拷贝数,结果表明,NGPV能感染鸭胚成纤维细胞,但病毒的增殖依赖于细胞的复制。接下来以感染复数MOI=1探究不同时间下的病毒感染对cGAS-STING信号途径的影响,结果显示随着时间的变化cGAS-STING信号途径逐渐被激活,而后逐渐被抑制,进一步研究不同MOI的NGPV感染DEF细胞,结果显示,随着感染复数的增加,cGASSTING信号通路逐渐被激活,干扰素和下游信号分子呈小幅上升趋势,但与对照组相比无显著差异,表明NGPV感染可以激活cGAS-STING信号通路,但诱导干扰素的能力很低。进一步通过NGPV感染DEF细胞,检测NGPV感染对ISD和poly(I:C)诱导的干扰素和下游干扰素诱导因子表达水平的影响,结果显示转染ISD和poly(I:C)显著诱导了DEF细胞干扰素及其刺激因子的表达,而NGPV感染可以有效抑制ISD和poly(I:C)诱导的干扰素的产生。为验证NGPV感染是否抑制了干扰素的分泌,通过ELISA检测发现NGPV感染诱导了低水平的干扰素分泌,且能抑制ISD、poly(I:C)诱导的干扰素分泌。对此,我们认为NGPV感染可调控cGAS-STING信号通路,保持低水平的干扰素表达,抑制宿主的抗病毒天然免疫反应。为进一步探究NGPV感染对DEF细胞转录组的影响。对DEF细胞进行以下处理并分组:A:NGPV组、B:NGPV+ISD组、C:MOCK组、D:ISD组,相关性热图结果显示,组内样本间的相关性良好,韦恩图结果显示,与对照组相比,A、B、D三组分别具有564、2953、1607个差异基因,三组处理有121个共同差异基因,对共同差异基因进行KEGG-pathway富集分析,富集的通路有病毒蛋白与细胞因子以及受体的相互作用(Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)、细胞因子与细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、百日咳(Pertussis)、补体和凝血级联(Complement and coagulation cascades)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等信号通路,GO富集分析发现,这些差异基因主要与细胞生长代谢、细胞组成成分和细胞的结合位点相关。为进一步研究NGPV感染造成的转录组变化,对NGPV感染与对照组的差异基因进行分析,火山图结果显示,NGPV感染后造成了320差异基因上调,244个差异基因下调,KEGG-pathway富集气泡图结果显示,主要富集基因有差异基因主要富集在病毒蛋白与细胞因子及其受体的相互作用(Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)、蛋白质消化和吸收(Protein digestion and absorption)、细胞因子-细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、化学致癌-DNA加合物(Chemical carcinogenesis-DNA adducts)、补体和凝血级联(Complement and coagulation cascades)等通路。KEGG-pathway分类结果显示,这些基因富集的差异基因主要富集在信号传导、信号分子及其相互作用、癌症、免疫、病毒感染相关通路,对病毒感染相关基因进行KEGG网络互作分析结果显示纤维蛋白基因1、整合素β3、趋化因子C-X3-C-基元配体1、白激素8、血小板反应蛋白等基因存在较多的连接节点。最后,分析冠状病毒19(Coronavirus disease-COVID-19)信号相关信号通路,证实NGPV感染抑制了经典抗病毒免疫相关通路,如MDA5/R

关键词：新型鹅细小病毒免疫逃逸干扰素病毒蛋白

两株番鸭源NGPV分离鉴定、基因全序分析及其qRT-PCR方法的建立

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两株番鸭源NGPV分离鉴定、基因全序分析及其qRT-PCR方法的建立

作者：王正一广西大学

学位级别：硕士

水禽细小病毒包括番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)和新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),其中新发病原NGPV是2015年春季以来,在我国樱桃谷鸭、半番鸭和番鸭等品种鸭中广泛流... 详细信息

水禽细小病毒包括番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)和新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),其中新发病原NGPV是2015年春季以来,在我国樱桃谷鸭、半番鸭和番鸭等品种鸭中广泛流行的一种由MDPV和GPV自然重组的新毒株,并给养鸭业造成巨大的经济损失。为了研究广西NGPV的流行情况,本研究开展了对NGPV的分离鉴定、全基因组序列分析,并建立了一种NGPV的qRT-PCR检测方法,为该病的研究和防控提供材料、检测方法和理论依据。论文的研究内容与结果如下:1、番鸭源NGPV GXYL201903和GXYL201907株的分离及鉴定为了解NGPV在广西的流行情况,本研究在2019年从广西壮族自治区玉林市两个疑似感染NGPV发病番鸭场的临床病料进行常规PCR检测和细菌的分离培养,结果所有样品检测出NGPV阳性,少数病鸭组织中分离出大肠杆菌。将NGPV阳性临床样品的肝脏和脾脏等组织按常规方法处理后,通过尿囊腔途径接种9～11日龄番鸭胚分离病毒。观察并记录番鸭胚死亡情况,收集病毒致死胚的尿囊液,进行PCR检测、目的基因片段基因克隆和测序鉴定,并用病毒分离株通过肌肉注射接种1日龄健康的雏番鸭,观察感染病毒雏番鸭的临床症状,统计雏番鸭的死亡情况,并对感染鸭组织样品进行PCR检测。结果表明,接种NGPV阳性样品病毒液的番鸭胚呈现胚体充血和发育迟缓。番鸭胚尿囊液NGPV PCR检测出约409 bp目的条带。目的片段序列分析结果证明为NGPV,把分离鉴定的两株NGPV分别命名为GXYL201903与GXYL201907。分离株人工感染试验结果显示,分离株GXYL201903与GXYL201907均能引起试验雏番鸭的生长迟缓、角弓反张和喙部发绀,肝脏、肾脏有出血点,纤维性肠炎等特征性症状和病变。取部分组织进行PCR检测,检测结果为NGPV阳性,表明动物试验感染成功,GXYL201903与GXYL201907分离株对1日雏番鸭有较强的致病力。2、NGPV GXYL201903和GXYL201907株全基因序列分析用Illumina Hi Seq对NGPV分离株GXYL201903与GXYL201907进行全基因组测序,得到了两株NGPV的全基因组序列。对GXYL201903与GXYL201907全基因组序列与水禽细小病毒参考毒株序列进行同源性分析,并构建遗传进化树。然后用分子生物学软件RDP和Sim Plot对分离株进行病毒重组分析,最后用分离株和其他水禽细小病毒参考株的衣壳基因进行贝叶斯系统发育树分析。结果表明,GXYL2012903株基因组全长为5083bp,衣壳基因为2406bp～4604bp;GXYL2012907株基因组全长5063bp,衣壳基因为2416bp～4616bp。全基因组序列分析显示GXYL201903与GXYL201907分离株与参考株的相似性都在88.7%～99.8%之间,GXYL201903与福建GPV D株相似性最高,为98.9%,GXYL201907与广东MDPV GD201911株、福建NGPV FJFZ20812株相似性最高为99.8%。病毒重组分析证明番鸭源NGPV毒株GXYL201903和GXYL201907为两株重组毒株。通过水禽细小病毒衣壳基因贝叶斯系统发育树显示,两株毒株均处于MDPV分支中;分子钟时间信号评估发现NGPV所在的MDPV分支中的进化速率恒定,基因突变持续增加;物种多样性在2010年后呈现一定程度的下降趋势。3、NGPV SYBR Green I荧光定量PCR方法的初步建立根据GXYL201907毒株VP3基因核苷酸序列设计了一段长244bp的特异性引物,通过PCR扩增、基因克隆测序鉴定后制备重组质粒,用SYBR Green I染料进行荧光定量PCR扩增,进行各种反应条件的优化和特异性、敏感性及重复性试验。结果表明,本研究建立了NGPV的qRT-PCR检测方法。建立的荧光定量PCR标准曲线方程为y=-3.1671x+31.03,线性相关系数R为0.9983,表明线性良好。特异性试验结果表明建立的方法只检测NGPV而不能检测出参考毒株如新城疫病毒(NDV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV),其检测结果灵敏度为9.66×10拷贝/μL,荧光定量PCR的灵敏度比常规PCR高100倍,可作为NGPV临床诊断和流行病学调查研究。综上所述,本研究成功分离并鉴定了两株广西玉林番鸭源NGPV毒株,通过对两株番鸭源NGPV毒株的全基因组测序及相似性、同源性分析,丰富了NGPV毒株生物信息;通过贝叶斯方法,对分离株的系统发育、病毒溯源及有效种群多样

关键词：新型鹅细小病毒分离鉴定全基因测序基因重组贝叶斯分析实时荧光定量PCR

GPV、NGPV VP2与转铁蛋白受体的相互作用研究及蛋白质结构预测分析

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GPV、NGPV VP2与转铁蛋白受体的相互作用研究及蛋白质结构预测分析

作者：孙洁山东农业大学

学位级别：硕士

鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒属的成员,该病毒从最初造成雏鹅、雏番鸭发生“小鹅瘟”,到1971年在法国造成半番鸭短喙与侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）,再到2015... 详细信息

鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒属的成员,该病毒从最初造成雏鹅、雏番鸭发生“小鹅瘟”,到1971年在法国造成半番鸭短喙与侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）,再到2015年新型鹅细小病毒（Novel,Goose parvovirus,NGPV）引起北京鸭短喙侏儒综合征（Duck beak atrophy and dwarfish syndrome,BADS）,病毒的宿主范围逐渐扩大,并出现了跨种间传播的现象,对我国乃至世界范围内的水禽健康高效养殖以及公共卫生产生了巨大威胁。病毒与细胞表面受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节,是影响病毒宿主特异性的决定性因素之一。先前的研究表明,细小病毒衣壳蛋白对于病毒的嗜性、宿主范围以及致病性具有重要意义。其VP2可以与宿主细胞表面的受体相互作用,使病毒进入细胞并增殖,从而发生有效感染。鉴于此,本研究以细小病毒衣壳蛋白VP2为研究对象,提出细胞膜上调控铁转运的跨膜蛋白-转铁蛋白受体（transferrin receptor,TfR）为病毒与宿主细胞结合的假设表面受体。TfR是质膜中高效表达的成分之一,也是病毒引发宿主细胞感染的有力靶标。通过生物信息学、分子生物学等研究方法,对病毒与受体的蛋白进行同源建模与结构预测分析,并分别验证GPV-VP2、NGPV-VP2蛋白与其自然宿主细胞表面受体TFR的互作情况。本研究主要内容如下:1、用序列结构分析软件对GPV、NGPV的衣壳蛋白VP2和鹅、鸭TfR进行比对分析;2、将诱饵质粒VP2-pGBKT7转化到Y2H酵母菌株中,猎物质粒TfR-PGADT7转化到Y187酵母菌株中,混合培养两个酵母菌株,验证鹅TfR与GPV VP2蛋白之间、鸭TfR与NGPV VP2蛋白之间的相互作用情况;3、为了防止假阳性,利用原核表达系统表达并纯化的VP2-GST融合蛋白与真核转染系统表达的TfR-HA融合蛋白进行GSTPull down体外互作试验;4、通过间接免疫荧光确定病毒与TfR的定位情况;5、制备特异性良好的TfR多克隆抗体,并用该多抗封闭GEF细胞和DEF细胞,封闭后吸附感染GPV和NGPV,荧光定量PCR方法测定多抗封闭细胞后病毒的感染效率。结果如下:序列结构分析表明,GPV VP2和NGPV VP2的6个位于病毒表面的氨基酸变异位点（S305N、S353N、A379G、K430R、H515N、D558N）均远离病毒与宿主受体相互作用的区域,提示变异不足以对病毒与受体的结合构成影响。经酵母双杂交系统与GST-Pull down试验证实,鹅TfR与GPV VP2蛋白发生相互作用;鸭TfR与NGPV VP2蛋白发生相互作用。激光共聚焦显微镜观察结果显示,GPV和NGPV病毒粒子分别吸附GEF细胞和DEF细胞后,能够与细胞膜表面的TfR发生共定位。荧光定量PCR结果显示,抗TfR的多克隆抗体封闭GEF细胞和DEF细胞后,可阻断病毒的入侵,降低感染效率。上述结果证明宿主细胞膜表面的TfR是GPV和NGPV的受体,是病毒吸附宿主细胞和感染过程中的重要蛋白,GPV、NGPV通过与其宿主表面TfR相互作用,从而造成鹅、鸭的感染。本研究对于理解GPV-宿主相互作用的分子机制、开发可阻断病毒感染的治疗药物以及制定针对GPV感染的干预策略至关重要。

关键词：新型鹅细小病毒衣壳蛋白转铁蛋白受体蛋白相互作用蛋白结构分析

DTMUV重组酶介导的等温扩增检测方法及DTMUV和N-GPV二重PCR检测方法的建立与应用

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DTMUV重组酶介导的等温扩增检测方法及DTMUV和N-GPV二重PCR检测方...

作者：林晓梅广西大学

学位级别：硕士

鸭坦布苏病毒病(duck Tembusu virus disease,DTMUVD)是由鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)引起的一种急性、接触性传染病。该病于2010年在中国暴发和流行,最初主要侵害种(蛋)鸭,后来肉鸭也有感染发病。DTMUV传播速度快、范围广... 详细信息

鸭坦布苏病毒病(duck Tembusu virus disease,DTMUVD)是由鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)引起的一种急性、接触性传染病。该病于2010年在中国暴发和流行,最初主要侵害种(蛋)鸭,后来肉鸭也有感染发病。DTMUV传播速度快、范围广,严重危害了我国养禽业的发展。近年来,我国商品肉鸭群流行以生长迟缓,鸭喙变短、舌头外露下垂为主要特征的鸭短喙-侏儒综合征(duck short beak and dwarfism syndrome,DSBDS),该病是由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,N-GPV)引起的一种传染性疾病,目前该病在肉鸭群中普遍流行。临床上时常有上述两种病原的混合感染,给疾病的诊断和防控增加了难度。建立能够快速诊断DTMUV感染及鉴别DTMUV和N-GPV的新型分子检测方法对于临床疾病的防控具有重要的意义。本研究针对DTMUV的E基因进行了引物和探针的设计与合成,建立了快速检测DTMUV的重组酶介导的等温扩增(Recombinase aided amplification,RAA)检测技术,同时针对DTMUV的NS5基因和N-GPV的VP1基因分别设计特异性引物并建立了检测DTMUV和N-GPV的二重PCR检测方法。具体内容如下。1、DTMUV的常规RAA检测方法的建立与应用本研究根据GenBank中的DTMUV毒株的E基因序列,依据RAA反应原理设计并筛选出1对引物,分别从反应温度、时间及引物浓度三个方面进行反应条件的优化,建立了DTMUV常规RAA检测方法,并对其特异性和敏感性进行分析。特异性结果显示,该方法仅能检测出DTMUV,而对NDV、N-GPV、DHAV-1、DHAV-3、DRV、IBV、a MPV和IBDV的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,常规RAA最低能够检测到2×10个拷贝质粒每反应,与普通PCR的敏感性相当。该方法耗时少,仅需15 min即可完成扩增。应用建立的方法对40份临床病料进行检测,DTMUV阳性率为22.5%,与普通PCR的检测结果100%符合。2、DTMUV的荧光RAA检测方法的建立与应用本研究根据荧光探针原理设计了一条探针,结合常规RAA技术建立了一种DTMUV荧光RAA检测方法,并对特异性和灵敏性进行了分析。特异性试验结果表明,该检测方法仅能扩增DTMUV模板,而对NDV、N-GPV、DHAV-1、DHAV-3、DRV、IBV、aMPV和IBDV的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,荧光RAA最低可检测到2×10个拷贝每反应的模板,敏感性比普通PCR和常规RAA均高1000倍。该方法检测5 min即可出现荧光曲线,20 min完成整个扩增与检测过程。用40份临床病料对建立的DTMUV荧光RAA进行检测评估,DTMUV检测阳性率为22.5%,与普通PCR和常规RAA的检测结果一致。3、DTMUV和N-GPV二重PCR检测方法的建立与应用本研究根据GenBank中DTMUV的NS5基因序列和N-GPV的VP1基因序列,设计两对特异性引物用于DTMUV和N-GPV的检测。经过反应体系与反应条件的优化,建立了检测DTMUV和N-GPV的二重PCR方法,并对其特异性、敏感性以及重复性进行了分析。特异性试验结果显示,该方法仅能扩增出DTMUV和N-GPV特异性目的条带,而对NDV、DHAV-1、DHAV-3、DRV、IBV、a MPV和IBDV的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对DTMUV和N-GPV的核酸模板最低检测浓度分别为58 fg和620 fg,而单一PCR对DTMUV和N-GPV的最低检测浓度分别为58 fg和62 fg;重复性试验结果表明建立的方法具有良好的重复性。用建立的方法对40份临床病料进行了检测,DTMUV和N-GPV的检出率分别为22.5%和30%,与单一PCR方法检测结果100%符合。综上所述,本研究首次成功建立了针对DTMUV常规RAA和荧光RAA检测方法,具有很好的特异性、较好的敏感性及快速检测的特点,适用于现场的快速检测;其次首次成功建立了针对DTMUV和N-GPV检测的二重PCR方法,该方法特异性强、敏感性高、检测快速,为两种疫病的快速检测提供了新的方法。

关键词：鸭坦布苏病毒重组酶介导的等温扩增技术荧光探针新型鹅细小病毒二重PCR 应用

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水禽细小病毒选择压力与基因重组分析

湖北农业科学 2023年第11期62卷 191-197页

作者：汪宏才商雨郭云清曾哲张蓉蓉温国元罗青平湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室武汉430064

通过对临床水禽细小病毒进行PCR检测、基因组测序和进化分析,确定分离毒株的基因型。进一步通过Paml、RDP软件对分离株的基因组进行选择压力和基因重组分析,确定分离株的演化趋势。结果表明,分离的3株水禽细小病毒均属于新型鹅细小病毒... 详细信息

通过对临床水禽细小病毒进行PCR检测、基因组测序和进化分析,确定分离毒株的基因型。进一步通过Paml、RDP软件对分离株的基因组进行选择压力和基因重组分析,确定分离株的演化趋势。结果表明,分离的3株水禽细小病毒均属于新型鹅细小病毒,分别命名为YiCH株、AnQ株和XiY株,基因组长度分别为5 056、5 056、5 068 bp。3个分离株与新型鹅细小病毒M15株亲源关系最近,其中XiY株两端ITR区域191~196位、4 878~4 883位均有6个碱基插入。对分离株进行选择压力分析,分离株VP蛋白检测出3个正选择位点,分别为116Q、261A、485S。重组分析显示,分离株YiCH株和AnQ株都存在重组现象,以XiY株为主要亲本株、GPV 06-0329株为次要亲本株重组而成。

关键词：水禽细小病毒新型鹅细小病毒分离鉴定选择压力基因重组