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饲粮25(OH)D3及钙水平对感染新型鹅细小病毒肉鸭生产性能和骨骼质量的影响

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饲粮25(OH)D3及钙水平对感染新型鹅细小病毒肉鸭生产性能和骨骼质...

作者：田江波四川农业大学

学位级别：硕士

本文通过两个试验探究注射新型鹅细小病毒(NGPV)JS1株对樱桃谷肉鸭生产性能和骨骼质量的影响及饲粮25(OH)D和钙水平对感染NGPV肉鸭生产性能和骨骼质量的影响。为进一步认识NGPV对肉鸭骨骼质量的影响提供理论依据,为生产上采用营养手段... 详细信息

本文通过两个试验探究注射新型鹅细小病毒(NGPV)JS1株对樱桃谷肉鸭生产性能和骨骼质量的影响及饲粮25(OH)D和钙水平对感染NGPV肉鸭生产性能和骨骼质量的影响。为进一步认识NGPV对肉鸭骨骼质量的影响提供理论依据,为生产上采用营养手段缓解短喙侏儒综合征提供数据支持。试验一:饲粮添加25(OH)D对感染NGPV肉鸭的生产性能和骨骼质量的影响本试验探究NGPV对肉鸭生产性能和骨骼质量的影响及饲粮添加25(OH)D对感染NGPV肉鸭的生产性能和骨骼质量的影响。试验采用2×2因子设计,设置4个处理,设置NGPV攻毒和不攻毒,攻毒鸭在1日龄注射NGPV-JS1株病毒溶液0.5 m L(5×10copies/m L),两个25(OH)D添加水平(0或69μg/kg),每个处理8个重复,每个重复4只肉公鸭。试验期35天。试验结果表明:NGPV显著降低肉鸭14 d和35 d体重、各阶段体增重和采食量(P0.05)。NGPV显著降低肉鸭7、14、21、28和35 d的喙长和喙宽(P0.05)。NGPV显著降低35 d肉鸭胫骨长、直径和灰分含量(P0.05)。添加25(OH)D显著提高35 d感染NGPV肉鸭胫骨长及灰分中磷含量(P0.05)。结果表明NGPV降低肉鸭生长性能,降低胫骨质量,饲粮中添加25(OH)D对肉鸭生产性能无显著影响,但显著升高感染NGPV肉鸭胫骨长,提高胫骨磷含量,提高胫骨质量。试验二:饲粮钙水平对感染NGPV肉鸭生产性能和骨骼质量的影响本试验探究饲粮钙水平对感染NGPV肉鸭生产性能和骨骼质量的影响。试验采用3×2因子试验设计,设置3个钙水平(1-14 d:0.65%,0.90%,1.15%;14-35 d:0.60%,0.85%,1.10%),设置NGPV攻毒和不攻毒,攻毒鸭在1日龄注射NGPV-JS1毒株0.5m L(5×10copies/m L),共6个处理,每个处理8个重复,每个重复8只鸭。试验期35天。试验结果表明:NGPV显著降低肉鸭14 d、35 d体重、各阶段体增重和采食量(P0.05)。NGPV显著降低肉鸭14 d、35 d喙长及喙宽(P<0.05),增加钙水平显著提高35 d相对喙长(P<0.05)。NGPV显著降低肉鸭胫骨鲜重、胫骨长、胫骨直径、胫骨强度、喙鲜重(P<0.05)。增加钙水平显著提高14 d胫骨直径和强度(P<0.05),显著升高感染NGPV肉鸭14 d胫骨长及喙鲜重(P<0.05),显著增加35 d感染NGPV肉鸭胫骨长(P<0.05)。NGPV显著降低14、35 d肉鸭胫骨脱脂重、胫骨灰分、喙脱脂重(P<0.05),饲粮钙水平升高显著增大14 d肉鸭胫骨灰分含量和喙脱脂重(P<0.05),显著增加35 d肉鸭胫骨灰分含量(P<0.05),显著增加35 d感染NGPV肉鸭喙脱脂重(P<0.05)。NGPV显著增加14、35 d肉鸭破骨细胞数量(P<0.05),增加钙水平显著减少35 d肉鸭破骨细胞数量(P<0.05)。增加钙水平显著降低35d血清TRAP含量(P<0.05)。NGPV有降低14 d肉鸭十二指肠Ca BP-28K表达的趋势(P<0.1),钙水平升高显著降低14 d肉鸭十二指肠Ca BP-28K、Na Pi-IIb的表达(P<0.05),NGPV显著降低35 d肉鸭十二指肠Ca BP-28K、Na Pi-IIb的表达(P<0.05)。NGPV显著升高14和35 d肉鸭胫骨生长板Cathepsin K基因的表达(P<0.05),并有降低35 d肉鸭胫骨ALP和Runx2表达的趋势(P<0.1)。结果表明NGPV显著降低肉鸭生产性能,降低骨骼质量;增加钙水平对肉鸭生产性能无显著影响,但显著提高感染NGPV肉鸭胫骨长及灰分含量,提高胫骨质量。全文结论:NGPV导致肉鸭生产性能下降,影响肉鸭喙和胫骨的发育,降低胫骨质量。饲粮2

关键词：短喙侏儒综合征新型鹅细小病毒肉鸭生产性能钙磷代谢

检测新型鹅细小病毒抗体的间接ELISA方法的建立及应用

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检测新型鹅细小病毒抗体的间接ELISA方法的建立及应用

作者：孙大鹏山东农业大学

学位级别：硕士

自2014年下半年来,我国安徽、江苏、山东等肉鸭养殖地区的樱桃谷鸭爆发了一种以鸭喙萎缩变短、舌外伸、生长发育障碍等为主要症状的传染病,暂时命名为鸭“短喙-侏儒综合症”(short beak and dwarfism syndrome,SBDS),民间俗称“鸭大舌... 详细信息

自2014年下半年来,我国安徽、江苏、山东等肉鸭养殖地区的樱桃谷鸭爆发了一种以鸭喙萎缩变短、舌外伸、生长发育障碍等为主要症状的传染病,暂时命名为鸭“短喙-侏儒综合症”(short beak and dwarfism syndrome,SBDS),民间俗称“鸭大舌病”。研究人员通过病毒的分离鉴定和动物回归试验,确定该病的病原为一种新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),与鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)属于同一进化支,两者核苷酸相似率95%以上。本研究通过建立优化一种适合临床检测NGPV抗体的间接ELISA方法,为NGPV的血清学诊断提供一种可靠的技术手段,利用该方法调查了来自不同地区的鸭血清样本,丰富了当下NGPV研究的血清学调查数据。具体研究内容如下:NGPV衣壳蛋白的原核表达及纯化:参照Genbank中NGPV的衣壳蛋白基因序列,分别设计扩增VP1与VP3基因的引物,从实验室保存的NGPV阳性病料中提取病毒D NA,以NGPV阳性DNA为模板扩增VP1与VP3基因,分别将VP1和VP3基因片段连接到pET-32a(+)表达载体上,构建pETVP1与pETVP3重组质粒,将重组质粒转化到*** BL21(DE3)表达菌中进行蛋白表达。利用尿素梯度法纯化表达后的DE3菌体蛋白,经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定VP1蛋白浓度为2.18μg/μL,VP3蛋白浓度为3.7μg/μL。Western blot试验表明,本试验所表达的VP1和VP3蛋白能够与NGPV阳性血清发生特异反应,不与其他病原的阳性血清及健康鸭血清反应。鸭血清中NGPV抗体检测的间接ELISA方法的建立及优化:分别应用VP1与VP3蛋白作为ELISA方法的包被抗原,在同等条件下检测相同NGPV阳性血清与健康鸭血清,ELISA结果显示VP3蛋白作为包被抗原的P/N值远高于VP1蛋白作为包被抗原的值,选取VP3蛋白作为包被抗原更为灵敏可靠,因此选用NGPV的VP3蛋白作为包被抗原用于建立检测血清中NGPV抗体的ELISA方法。经过条件的摸索与优化,ELISA检测方法的最佳条件为:VP3蛋白包被浓度为2μg/mL;封闭液选择5%脱脂奶粉(250μL/孔),封闭2h;样本血清进行400倍稀释(100μL/孔),37℃条件下孵育1.5h;羊抗鸭二抗进行4000倍稀释(100μL/孔),37℃封闭2h;TMB显色液(100μL/孔)避光作用10min。应用建立的间接ELISA方法检测36份NGPV阴性鸭血清,根据统计学原理计算该ELISA方法的临界值,当血清样品的OD值S≥0.2024时,样品为阳性;当样品的OD值S≤0.183时,样品为阴性。对建立的ELISA方法进行特异性检验,结果表明该方法不与鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)的抗体发生交叉反应。重复性检验结果显示,同一样本在同一批次试验和不同批次的试验中数值差异极小,表明该间接ELISA方法具有良好的重复性。使用间接ELISA方法和中和试验两种方法检测120份血清样品,结果显示这两种检测方法的符合率为85.8%。间接ELISA检测方法的临床应用:本研究应用建立的用于NGPV抗体检测的ELISA方法对山东省5个鸭场共计970份血清样品进行检测。结果表明,5个鸭场的群体NGPV阳性率为100%,每个鸭场的个体阳性率从17.6%-62.6%不等,潍坊个体检出率最高(62.6%),泰安地区两鸭场的个体检出率较低,其中新泰场检出率为17.6%,肥城场检出率为26.0%,970份血清样品的平均阳性率为39.7%。

关键词：新型鹅细小病毒衣壳蛋白原核表达间接ELISA 血清学调查

德州地区新型鹅细小病毒流行病学调查及DZ-01株新型鹅细小病毒全基因组序列分析

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德州地区新型鹅细小病毒流行病学调查及DZ-01株新型鹅细小病毒全...

作者：吴蓓山东农业大学

学位级别：硕士

鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)是细小病毒科细小病毒属成员,能够感染雏鹅和雏番鸭,导致具有高死亡率的急性传染病。自2014年下半年以来,我国各商品化肉鸭养殖场不断有爆发一种鸭喙短侏儒综合征(short beak and dwarfism syndrome,SB... 详细信息

鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)是细小病毒科细小病毒属成员,能够感染雏鹅和雏番鸭,导致具有高死亡率的急性传染病。自2014年下半年以来,我国各商品化肉鸭养殖场不断有爆发一种鸭喙短侏儒综合征(short beak and dwarfism syndrome,SBDS)的疾病。Chen等人通过分离病毒和分子病原学鉴定,确定为新型鹅细小病毒(Novel Goose Parvovirus,NGPV),本研究的目的是对山东德州地区发生鸭喙短侏儒综合征的5个樱桃谷鸭养殖场进行流行病学调查,并从山东德州地区患SBDS的樱桃谷肉鸭中分离一株鹅细小病毒,对其进行全基因组测序及同源性和进化树的分析。1.对山东德州地区樱桃谷鸭感染新型鹅细小病毒的流行病学调查根据GeneBank上登陆的传统GPV新型GPV的基因组数据,用Primer5.0软件设计了 GPV的PCR检测引物。对山东德州地区的5个发病鸭群40只发病鸭分别提取心、肝、肾、脾、肺、胸腺、胰腺、法氏囊、胆汁、脑10个脏器的总DNA,共计400份样品进行PCR检测,统计这5个发病鸭场40只病鸭的个体检出率和各脏器GPV的阳性检出率。结果显示每个鸭群的最高阳性检出率为100%,最低阳性检出率为62.5%,平均检出率为82.5%,除了脑没检出病毒核酸外,其他脏器中病毒核酸检出率最高为心脏(82.5%),最低为肺脏(15%),平均检出率为45%。流行病学调查结果表明,山东德州地区的新型鹅细小病毒在各樱桃谷肉鸭养殖场感染范围广,发病严重,给养殖户造成的损失较大。***-01株NGPV的全基因组测序及基因进化分析参考GeneBank已登陆公布的12株传统鹅细小病毒和2株樱桃谷鸭源鹅细小病毒序列,用Primer5.0软件设计5对扩增樱桃谷鸭源新型鹅细小病毒全基因组序列的引物,对分离的DZ-01毒株进行分段扩增并测序,拼接后获得该株鹅细小病毒的全基因组序列,并与其它传统鹅细小病毒和新型鹅细小病毒全基因组序列进行同源性分析和进化树的构建。经过比对分析,DZ-01株的全基因组与其他的12株GPV同源性在92.7～97.2%,,与MDPV同源性最高仅为85.0%,与已登陆的NGPV同源性在99.3%～99.7%,进化树分析发现DZ-01株NGPV属于GPV这一大分支,与sdlc01株和QH15株在同一个小的分支上,对DZ-01株的VP3基因与12株GPV的同源性分析,发现DZ-01株的VP3与GDaGPV的同源性最低为93.1%,与82-032v最高为98.5%,DZ-01与QH15株和sdlc01株同源性为99.7%和100%,DZ-01株的VP3蛋白与12株GPV的VP3蛋白比对,同源性与GDaGPV最低分别为96.6%,DZ-01与B株的同源性最高,为98.7%,DZ-01与NGPV的sdlc01株和QH15株相比同源性分别为100%和99.6%。进化树的分析显示,DZ-01、sdlc01和QH15分布在同一个小分支上,而与传统的GPV毒株相对距离较远。

关键词：传统鹅细小病毒新型鹅细小病毒全基因组分析流行病学调查

3株樱桃谷鸭源新型鹅细小病毒的分离及分子特征解析

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中国动物传染病学报 2022年第2期30卷 7-13页

作者：贾婧宇秘清灵李勇霖李玉峰于可响王建业朱国强扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 山东省农业科学院家禽研究所济南250023

为了深入揭示引起樱桃谷鸭短喙与矮小综合征(SBDS)的新型鹅细小病毒(NGPV)的鹅胚增殖特性及分子特征,对从山东省不同地区采集的3份SBDS典型病例在9日龄鹅胚上进行了病毒分离,并对其全基因组序列及编码蛋白序列进行比对。结果成功分离到3... 详细信息

为了深入揭示引起樱桃谷鸭短喙与矮小综合征(SBDS)的新型鹅细小病毒(NGPV)的鹅胚增殖特性及分子特征,对从山东省不同地区采集的3份SBDS典型病例在9日龄鹅胚上进行了病毒分离,并对其全基因组序列及编码蛋白序列进行比对。结果成功分离到3株NGPV,分别为SDHT16、SDJN19和SDLC19。3株病毒均能在鹅胚中稳定传代,但致死鹅胚的时间明显长于经典型GPV。3株NGPV之间基因组的同源性高达98.9%~99.7%,而与经典GPV强毒株的同源性则稍低,为95.2%~96.1%。基于3株NGPV与已发表的NGPV毒株和经典GPV强毒株的编码蛋白比对分析显示,与国内经典GPV强毒株相比,NGPV毒株结构蛋白VP1共产生了16个氨基酸点突变,其中9个氨基酸位点与欧洲的B株相同;非结构蛋白Rep1则产生了12个氨基酸位点突变。与经典GPV LH株的末端倒置重复序列(ITR)相比,SDHT16、SDJN19和SDLC19在ITR的回文区茎部分别多出2、4、4个碱基,ITR的同源性达到98.1%~100.0%,而与LH株的同源性为93.0%~94.0%。本研究结果为今后进一步深入研究NGPV的致病机制奠定了基础。

关键词：短喙与矮小综合征新型鹅细小病毒分离分子特征末端倒置重复序列

基于16SrRNA与转录组学测序分析新型鹅细小病毒对雏鸭的致病性

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基于16SrRNA与转录组学测序分析新型鹅细小病毒对雏鸭的致病性

作者：王璐瑶河北农业大学

学位级别：硕士

新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的感染对我国养鸭业造成巨大经济损失,目前对其相关致病机制的研究鲜有报道。本研究用NGPV感染3日龄雏鸭,建立鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)动物模型。在NGP... 详细信息

新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的感染对我国养鸭业造成巨大经济损失,目前对其相关致病机制的研究鲜有报道。本研究用NGPV感染3日龄雏鸭,建立鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)动物模型。在NGPV感染第2d左右雏鸭出现扎堆、精神萎靡的现象;在感染第4 d左右观察到有个别雏鸭出现站立困难、拉稀现象;在感染第14 d时感染组雏鸭喙长显著低于对照组(P病毒载量,结果显示:在NGPV感染第2d时病毒载量在各组织达到高峰,感染第28 d时各组织仍带毒,且各组织病毒载量在感染同一时间点均无显著差异,表明NGPV具有泛嗜性。利用16SrRNA测序技术和气相色谱法对感染NGPV 14 d、21 d、28 d后的雏鸭盲肠内容物进行检测分析,探究NGPV感染对雏鸭盲肠微生物群的影响。结果显示:雏鸭感染NGPV14 d时盲肠微生物多样性显著降低(P病毒信号通路。本研究探讨了雏鸭感染NGPV后盲肠微生物失调与形成侏儒、短喙、易骨折等临床症状可能存在的内在联系及激活宿主免疫反应的相关信号通路。以上试验结果以期为NGPV的致病机制的研究提供一定理论基础。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙与侏儒综合征 16SrRNA测序转录组测序盲肠微生物短链脂肪酸

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新型鹅细小病毒研究进展

中国动物传染病学报 2020年第2期28卷 115-118页

作者：王辉王秀云焦绪娜尹延敏逄宾宾潍坊华英生物科技有限公司潍坊261108

新型鹅细小病毒主要引起发病鸭临床表现为短喙、舌外伸、生长发育受阻的疾病,根据该病临床特征又称为“鸭短喙侏儒综合症”。本文综合了目前最新的新型鹅细小病毒研究,并与经典鹅细小病毒在流行病学、临床症状、生物学特性、检测方法方... 详细信息

新型鹅细小病毒主要引起发病鸭临床表现为短喙、舌外伸、生长发育受阻的疾病,根据该病临床特征又称为“鸭短喙侏儒综合症”。本文综合了目前最新的新型鹅细小病毒研究,并与经典鹅细小病毒在流行病学、临床症状、生物学特性、检测方法方面进行对比,突出了新型鹅细小病毒在发病宿主、临床和剖检症状、核苷酸序列方面发生的改变,以期为新型鹅细小病毒病的诊断、检测、及流行病学调查提供依据。

关键词：鹅细小病毒新型鹅细小病毒鸭短喙侏儒综合症

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新型鹅细小病毒研究进展

中国动物传染病学报 2019年第4期27卷 102-107页

作者：卞国志马海彬罗梦萍龚凤平王贵平廖明袁建丰华南农业大学兽医学院广州510642 广东海大畜牧兽医研究院有限公司广州511400

鸭细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)或番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)引起的一种传染病。经典MDPV和GPV毒株引起的病鸭主要症状为腹泻、脚软、渗出性肠炎,三周龄内雏鸭感染发病率和死亡率都很高。但是2008... 详细信息

鸭细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)或番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)引起的一种传染病。经典MDPV和GPV毒株引起的病鸭主要症状为腹泻、脚软、渗出性肠炎,三周龄内雏鸭感染发病率和死亡率都很高。但是2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地的雏半番鸭和樱桃谷鸭陆续出现一种新型细小病毒病,该病发病率10%~30%,病死率低于3%,临床症状主要为软脚、短嘴和生长障碍。通过对该病病原进行全基因组测序及系统发育树分析,结果发现该病原与鹅细小病毒亲缘性很近。本文通过比较新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,N-GPV)与经典的MDPV和GPV在基因组、感染宿主范围和致病性的区别,为新型鹅细小病毒病的防控提供理论依据。

关键词：新型鹅细小病毒鹅细小病毒番鸭细小病毒

鸭源新型鹅细小病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

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中国动物传染病学报 2020年第5期28卷 31-36页

作者：曹旭阳王宇飞张志飞魏笑笑秦立廷陈佶慧滕巧泱杨健美刘芹防陈鸿军李泽君李景环李雪松内蒙古师范大学生命科学与技术学院呼和浩特010022 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 山东新希望六和集团有限公司青岛266000

2015年暴发了一种由新型鹅细小病毒(NGPV)引起的鸭喙萎缩-侏儒症(BADS)的疾病,造成了严重的经济损失。本研究根据GenBank中NGPV相对保守的VP3基因序列,设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,并对其反应条件进行优化,建立了一种检测NGPV的Ta... 详细信息

2015年暴发了一种由新型鹅细小病毒(NGPV)引起的鸭喙萎缩-侏儒症(BADS)的疾病,造成了严重的经济损失。本研究根据GenBank中NGPV相对保守的VP3基因序列,设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,并对其反应条件进行优化,建立了一种检测NGPV的TaqMan荧光定量PCR方法。敏感性试验结果表明,该方法检测敏感性达到37.2拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高100倍,而且该方法对鸭其他主要病原核酸检测均为阴性,具有良好的特异性。批内和批间的检测变异系数均小于等于2.2%。对收集的50份病料进行检测,本研究建立的荧光定量PCR方法NGPV检出率为78%,普通PCR方法为50%,荧光定量PCR方法的敏感性明显高于普通常规PCR方法。研究结果表明该方法具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可用于NGPV的快速诊断。

关键词：新型鹅细小病毒荧光定量PCR 检测

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鸭源鹅细小病毒样颗粒的构建及其免疫原性评估

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鸭源鹅细小病毒样颗粒的构建及其免疫原性评估

作者：马瑶武汉轻工大学

学位级别：硕士

鸭源鹅细小病毒是一种新型鹅细小病毒（Novel Goose Parvovirus-related Virus,NGPV）,属于鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）的变种。其主要感染30日龄以内的雏鸭,典型的临床症状为生长缓慢、喙短舌突出、体重降低,严重影响鸭出栏率... 详细信息

鸭源鹅细小病毒是一种新型鹅细小病毒（Novel Goose Parvovirus-related Virus,NGPV）,属于鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）的变种。其主要感染30日龄以内的雏鸭,典型的临床症状为生长缓慢、喙短舌突出、体重降低,严重影响鸭出栏率,给养鸭行业带来了巨大的经济损失。疫苗接种是预防细小病毒的最佳方法,目前在我国已上市的疫苗有弱毒活疫苗（SYG61v株、GD株）、小鹅瘟灭活疫苗（TZ10株）等,但是弱毒活疫苗存在毒力返强风险,灭活苗存在免疫保护效果不佳的问题。新型疫苗能够弥补传统疫苗的缺陷,因此,研制安全性高、免疫原性良好且效果稳定的新型疫苗对于新型鹅细小病毒的防控具有重要的意义。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由一个或者多个病毒蛋白质组装而成的与天然病毒结构相似的颗粒,但缺乏病毒遗传物质,不能复制和二次感染。以VLPs开发的疫苗可以诱导机体产生细胞和体液等多种免疫应答,具有安全性高、免疫原性好的特点。本研究利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中成功组装了鸭源鹅细小病毒的VLPs,并研究其免疫原性,评估其作为新型鹅细小病毒疫苗的潜力。此外,建立了相配套的鸭源NGPV抗体间接ELISA检测方法。具体研究内容包括:1.鸭源鹅细小病毒VLPs的制备及免疫原性研究鸭源鹅细小病毒全基因组含有两个开放阅读框（ORFs）,分别编码非结构蛋白（Non-structural Protein,NS）和结构蛋白（Viral structural protein,VP）。VP2蛋白是鸭源鹅细小病毒的主要核衣壳蛋白之一,可以自主组装VLPs。本研究以实验室保存的鸭源鹅细小病毒Yich株基因组为模板,PCR扩增全长VP2基因,并在VP2基因的5'端加入Flag标签序列,获得融合片段t VP2。将片段t VP2插入杆状病毒供体质粒p Fast Bac-Dual的P10启动子下,构建重组供体质粒p FB-t VP2。通过转座,将p FB-t VP2中t VP2基因插入到杆状病毒基因组中,形成重组杆状病毒基因组p Ac-t VP2。利用转染和感染实验,拯救获得表达VP2基因的重组杆状病毒r Ac-t VP2。用IFA、Western-blot方法检测VP2基因的表达,结果表明感染r Ac-t VP2的Sf9细胞能够表达t VP2蛋白,且t VP2蛋白主要以可溶形式表达。将感染r Ac-t VP2的Sf9细胞制成切片,在透射电镜下观察,发现感染的细胞中有类似细小病毒的颗粒聚集。利用密度梯度离心纯化VLPs,SDS-PAGE检测显示,氯化铯上层有一条大小在70k Da左右的特异性条带出现。以鼠源Flag-tag单克隆抗体为一抗,对氯化铯上层进行Western-blot检测,结果显示氯化铯上层有一条大小在70k Da左右的特异性条带出现,说明纯化的VLPs主要位于氯化铯上层。然后利用纳米粒度仪测定纯化的VLPs大小为30nm左右,透射电镜检测发现粒子的形态和大小与NGPV病毒相似,表明重组VP2蛋白在昆虫细胞中成功组装形成VLPs。将纯化的VLPs与佐剂按一定的比例的混合乳化制成疫苗,对1日龄雏鸭进行初次免疫,并在初次免疫后14d进行加强免疫。分别在初次免疫后7、14d以及加强免疫后7、14d采集和分离鸭血清,用间接ELISA方法检测细小病毒抗体水平,结果显示初次免疫后的7、14d抗体水平不断提高;加强免疫后的7d抗体水平有所下降但是还是处于临界值以上,加强免疫后的14d抗体水平出现了显著上升,表明制备的VLPs疫苗能够刺激免疫鸭群产生鸭源鹅细小病毒的中和抗体。在加强免疫14d后,用鸭源鹅细小病毒Yich株进行攻毒试验。在攻毒后的3d随机取3只试验鸭进行剖杀,取各脏器制备病理切片观察组织病变。结果表明未免疫组与空白对照组相比,组织明显发生了病变,免疫组与空白对照组相比,组织无明显病变,表明制备的VLPs疫苗能够降低感染鸭源鹅细小病毒后的组织损伤。2.鸭源鹅细小病毒抗体间接ELISA方法的建立目前市场上没有商品化的检测鸭血清抗体试剂盒出售,因此需要建立一个间接ELISA方法用于鸭血清中抗体的检测。VP主要有VP1、VP2、VP3三种,是细小病毒组织嗜性、致病性和宿主范围的重要决定因素。它们在3'端区具有相同的基因序列和相同的终止密码子,但是它们的翻译起始密码子位于不同的位置。其中VP3占整个衣壳蛋白的80%,包含丰富的抗原决定簇。利用DNASTAR软件对VP3蛋白的抗原表位进行分析,选择抗原表位富集区（aa250-525）进行表达。以实验室保存的新型鹅细小病毒Yich株基因组为模板,利用PCR方法扩增VP3截短片段（aa250-525）,并插入大肠杆菌表达载体p ET-28a中,构建重组质粒p

关键词：新型鹅细小病毒间接ELISA 病毒样颗粒免疫原性评估