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鸭源新型鹅细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及应用

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鸭源新型鹅细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及应用

作者：刘琳敏河北农业大学

学位级别：硕士

鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,BADS)是从 2015 年在我国河北、山东和江苏等地开始大规模爆发的具有传染性的疾病,其主要特征是造成了雏鸭的发育不良,喙变短而舌头外伸与肿胀,造成我国养鸭业肉鸭出栏率明显降低... 详细信息

鸭短喙与侏儒综合征(Short beak and dwarfism syndrome,BADS)是从 2015 年在我国河北、山东和江苏等地开始大规模爆发的具有传染性的疾病,其主要特征是造成了雏鸭的发育不良,喙变短而舌头外伸与肿胀,造成我国养鸭业肉鸭出栏率明显降低和巨大经济损失。该病的病原被鉴定为新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),也称为鸭源鹅细小病毒、新型鸭细小病毒等。近几年,虽然国内许多学者开展了针对鸭短喙与侏儒综合征的相关研究,但关于此病以及NGPV相关研究基础少之又少。本研究根据NGPV VP2基因序列,设计了一对引物用于特异性扩增VP2序列。VP2基因片段利用PCR技术进行体外扩增,纯化后克隆到原核表达载体pET-32a中,将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导。通过SDS-PAGE鉴定蛋白表达、蛋白可溶性和纯化效果。实验结果表明,His-VP2蛋白的分子量约为83kDa,主要以包涵体形式表达。纯化后的蛋白没有明显的杂带,表明该蛋白被成功纯化,并作为后续制备单克隆抗体提供基础材料。按照标准免疫程序,经过颈背部皮下注射VP2蛋白于BALB/c小鼠。取出小鼠脾脏制成细胞悬液,与SP2/0进行细胞融合,利用间接ELISA鉴定生长的杂交瘤细胞株。单克隆抗体与VP2蛋白和病毒的反应性分别利用Western blot和IFA方法进一步鉴定。通过体外和体内的方法大量生产单克隆抗体,并通过间接ELISA测定单克隆抗体的效价。在本研究中,成功地获得了 6株阳性杂交瘤细胞系,将其分别命名为2C4,4B12,4G6,6H1,7C8和7C10。其中4B12、4G6和7C8的抗体效价较高,并且这3株单克隆抗体都属于IgG1型,轻链为kappa链,Western blot与IFA结果显示这3株单克隆抗体与蛋白质和病毒都表现出良好的结合反应性。表明单克隆抗体制备成功,并为后续的研究提供重要工具。针对VP2蛋白设计截短肽,利用单克隆抗体4B12、4G6和7C8作为一抗,通过Western blot鉴定截短蛋白与单克隆抗体的结合情况,再根据鉴定结果设计引物,以与上述相同的方法制备和鉴定进一步截短的蛋白,直至确定最小抗原表位。结果显示,共确定了三个针对VP2 的抗原表位"38DGGATAE44"、"546WNPEIQF552"和"461RDIYLQGPIWAK472"。这三个表位在水禽细小病毒中较为保守,"38DGGATAE44"和"546WNPEIQF552"位于VP2蛋白表面且亲水性良好,而"461RDIYLQGPIWAK472"大部分氨基酸位于蛋白内部,亲水性也最差。表明三个抗原表位鉴定成功,可为NGPV分子结构与功能以及致病机制的进一步研究提供参考。利用单克隆抗体初步建立NGPV抗体检测阻断ELISA方法,经过条件优化后,将程序确定为:抗原以4μg/mL的量于4℃包被过夜,以5%FBS作为封闭液于37℃封闭1h,待测血清以1:2比例稀释后于37℃孵育1.5h,单克隆抗体以1:25600比例稀释后于37℃孵育0.5h,酶标二抗以1:8000比例稀释后于37℃孵育0.5h,双组分TMB避光显色15min。判定标准为:当样本阻断率大于33.53%时可判定为阳性,当样本阻断率小于26.39%时可判定为阴性,当样本阻断率介于33.53%与26.39%之间时判定为可疑。特异性实验结果显示,此方法特异性识别NGPV阳性鸭血清;敏感性实验结果显示,当阳性血清样本稀释至1:160时,此方法阻断率仍可达40.55%,敏感性良好。此方法的批内、批间重复性实验结果显示,变异系数均小于10%,重复性好。符合率实验结果显示,此方法符合率可达96%。用建立的方法对临床收集的143份血清进行抗体检测,共检测出26份阳性样本,11份可疑样本以及106份阴性样本。建立的该检测方法为国内NGPV抗体的检测提供了重要工具。综上所述,本研究成功制备了 6株抗NGPV VP2单克隆抗体,利用单克隆抗体成功鉴定出位于VP2蛋白上的三个抗原表位;并且基于单克隆抗体成功建立了 NGPV抗体检测阻断ELISA方法,为鸭短喙与侏儒综合征流行病学调查以及疫苗免疫效果的评价提供重要检测手段。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙与侏儒综合征单克隆抗体表位阻断ELISA

一株新型鹅细小病毒的分离鉴定及抗鹅细小病毒单克隆抗体的研制

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一株新型鹅细小病毒的分离鉴定及抗鹅细小病毒单克隆抗体的研制

作者：吉李飞扬州大学

学位级别：硕士

小鹅瘟（Gosling Plague,GP）是由鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起的以肠道栓塞为典型病变的一种急性或亚急性败血性传染病。该病主要侵害4-20日龄雏鹅,传染快及病死率高,给鹅养殖业带来了严重的经济损失。短喙与侏儒综合征（Sh... 详细信息

小鹅瘟（Gosling Plague,GP）是由鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起的以肠道栓塞为典型病变的一种急性或亚急性败血性传染病。该病主要侵害4-20日龄雏鹅,传染快及病死率高,给鹅养殖业带来了严重的经济损失。短喙与侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）是发生于肉鸭的由新型鹅细小病毒（Novel Goose Parvovirus,NGPV）引起的一种传染病。SBDS自发生以来,发病率有逐年升高趋势,发病鸭因采食困难导致生长发育受阻,影响肉鸭出栏率,给肉鸭养殖业带来了经济损失。本研究在分离鉴定到一株新型鹅细小病毒的基础上,对鹅细小病毒的VP1、VP2及VP3蛋白进行了杆状病毒表达系统的表达以及研制出了 4株抗鹅细小病毒的特异性单克隆抗体。研究结果为进一步明确新型鹅细小病毒在国内的分子流行病学以及为开发鹅细小病毒有效免疫防控技术提供了材料,打下了基础。1.一株新型鹅细小病毒的分离鉴定与序列分析为了揭示引起肉鸭短喙与侏儒综合征的新型鹅细小病毒的分子特征,本研究对采集的疑似短喙与侏儒综合征典型病例样品,通过接种10日龄鸭胚进行了病毒分离鉴定。结果分离鉴定到一株新型鹅细小病毒,命名为NGPV-SDLQ21。核苷酸比对发现,NGPV-SDLQ21与其他NGPV以及GPV参考株NS1基因同源性分别在98.8%-99.8%以及93.6%-96.9%之间,VP1基因同源性分别在96.3%-99.8%以及92.8%-96.2%之间。与GPV参考株相比,NGPV-SDLQ21以及其他NGPV参考株在非结构蛋白NS1出现了9个氨基酸突变位点,在结构蛋白VP1也产生了 9个氨基酸突变位点。以上新型鹅细小病毒NGPV-SDLQ21的分离鉴定及其分子特征分析,丰富了国内新型鹅细小病毒分子流行病学数据。2.鹅细小病毒VP1、VP2及VP3蛋白在杆状病毒表达系统中的表达为开发诊断用抗原以及潜在的亚单位疫苗,本研究将GPV细胞适应毒CZM-142的VP1、VP2及VP3基因首先克隆至供体质粒pFastBacHTA中,随即转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆粒rBacmid-VP1、rBacmid-VP2及rBacmid-VP3,再转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-VP1、rBac-VP2及rBac-VP3。IFA以及Western-blot证明,重组杆状病毒rBac-VP1、rBac-VP2及rBac-VP3表达的鹅细小病毒VP1、VP2及VP3蛋白均能被抗GPV 阳性鼠血清特异性识别。此外,以重组杆状病毒rBac-VP3表达的VP3蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鹅细小病毒抗体的间接免疫荧光方法。特异性检测发现,该IFA方法仅与抗GPV 阳性鹅血清反应,而与所检测的抗其他病原的血清不反应。以上表达鹅细小病毒VP1、VP2及VP3蛋白的重组杆状病毒rBac-VP1、rBac-VP2及rBac-VP3的成功构建,以及基于重组杆状病毒rBac-VP3表达的VP3蛋白初步建立的检测GPV抗体的IFA方法为进一步研制GPV血清学诊断技术及亚单位疫苗提供了抗原及技术支撑。3.抗鹅细小病毒单克隆抗体的研制为筛选获得抗GPV的特异性单克隆抗体,本研究以GPV细胞适应毒CZM-142作为免疫原,免疫6-8周龄BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤细胞融合技术以及间接免疫荧光筛选方法进行了抗GPV特异性单克隆抗体研制。结果获得4株能够稳定分泌抗GPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为GPV-Mab-2F4、GPV-Mab-2F9、GPV-Mab-4D9及GPV-Mab-6E11。亚类鉴定发现4株单克隆抗体亚类均为IgG,轻链均为κ链。4株单克隆抗体小鼠腹水IFA效价在1:3200-1:6400之间。特异性试验表明,4株单克隆抗体仅与GPV反应,而与所检测的鹅星状病毒（Goose Astrovirus,GAstV）等其他病原均无交叉反应性。中和试验表明,4株单克隆抗体具有病毒中和活性。4株单克隆抗体均能与感染重组杆状病毒rBac-VP1、rBac-VP2及rBac-VP3的sf9细胞发生特异性反应,说明4株单克隆抗体识别表位均位于VP3蛋白。此外,4株单克隆抗体均能特异性识别LMH细胞表达的NGPV-SDLQ21的VP3蛋白。以上4株抗GPV特异性单克隆抗体的研制为进一步解析GPV的VP3蛋白B细胞表位以及为GPV的诊断提供了材料。

关键词：新型鹅细小病毒分离鉴定重组杆状病毒 VP 1-3 单克隆抗体

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新型鹅细小病毒病的诊断

中文科技期刊数据库（全文版）农业科学 2022年第3期 151-153页

作者：王淑娟山东省临朐县畜牧业发展中心山东潍坊262600

因新型鹅细小病毒所引起的新型鹅细小病毒病有很高的发病率与死亡率,且具有非常强的传染性,给水禽养殖业的稳健发展带来了很大影响。为此,从新型鹅细小病毒的病原学特征、流行病学特征等方面进行深入探讨;分析了新型鹅细小病毒的遗传稳... 详细信息

因新型鹅细小病毒所引起的新型鹅细小病毒病有很高的发病率与死亡率,且具有非常强的传染性,给水禽养殖业的稳健发展带来了很大影响。为此,从新型鹅细小病毒的病原学特征、流行病学特征等方面进行深入探讨;分析了新型鹅细小病毒的遗传稳定性、基因重组和突变等基因组的演化特点;提出了新型鹅细小病毒的诊断技术及病毒分离方法。

关键词：新型鹅细小病毒病原学特征诊断

新型鹅细小病毒四川株的全基因组扩增及遗传进化分析

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四川农业大学学报 2017年第4期35卷 574-580页

作者：葛志琪刘亚刚陈舜朱德康刘马峰汪铭书贾仁勇孙昆峰杨乔吴英赵新新程安春西南民族大学生命科学与技术学院成都610041 四川农业大学动物医学院预防兽医研究所成都611130 四川农业大学动物医学院禽病防治与研究中心成都611130 四川农业大学动物医学院动物疾病与人类健康四川省重点实验室成都611130

【目的】了解四川地区新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的分子生物学特征及遗传变异情况。【方法】根据Gen Bank中发表的新型鹅细小病毒的全基因组序列,设计5对兼并引物采用PCR方法分段扩增新型鹅细小病毒四川株的全基因组... 详细信息

【目的】了解四川地区新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)的分子生物学特征及遗传变异情况。【方法】根据Gen Bank中发表的新型鹅细小病毒的全基因组序列,设计5对兼并引物采用PCR方法分段扩增新型鹅细小病毒四川株的全基因组序列,并利用DNAstar等生物信息分析软件对获得的基因组序列进行分子特性与遗传演变分析。【结果】获得的新型鹅细小病毒四川株(命名为SC16)全长5 109 nt,5′端ITR长408 nt,3′端ITR长407 nt,NS基因长1 884 nt,VP基因长2 199 nt。序列比对和遗传进化分析显示,SC16株与山东分离株SDLC01(KT343253.1)及QH15(KT751090.1)的基因组核苷酸同源性高达99%,与两者的亲缘关系最近,基于NS及VP蛋白的氨基酸序列系统进化树分析结果与此一致。但SC16株的5′端ITR还是发生了一定的变异:与SDLC01及QH15相比,多了几个14 nt的插入片段。【结论】研究结果丰富了NGPV的分子生物学资料。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙侏儒综合征全基因组扩增遗传进化分析

新型鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达及荧光定量PCR检测方法的建立

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新型鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达及荧光定量PCR检测方法的建立

作者：曹旭阳内蒙古师范大学

学位级别：硕士

新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)是一种能够引发鸭的“喙萎缩-侏儒症(beak atrophy and dwarfism syndrome,BADS)”的病原,该病能导致番鸭大舌且短喙、生长缓慢或侏儒。NGPV多导致10-30 d龄左右的肉鸭感染,虽然死亡率与发... 详细信息

新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)是一种能够引发鸭的“喙萎缩-侏儒症(beak atrophy and dwarfism syndrome,BADS)”的病原,该病能导致番鸭大舌且短喙、生长缓慢或侏儒。NGPV多导致10-30 d龄左右的肉鸭感染,虽然死亡率与发病率较低,但是导致我国养鸭业残鸭、僵鸭高达60%左右的淘汰率,使国产鸭业经济损失重大。新型鹅细小病毒的VP3蛋白含有病毒的主要抗原决定簇,构成该病毒的主要抗原表位,而且在病毒的吸附以及病毒侵入宿主细胞的过程中都起着重要作用。本研究用PCR方法扩增NGPV的VP3基因,然后连接到原核表达载体pCold-TF上,转化入*** BL21感受态细胞,成功构建VP3基因表达载体pCold-VP3,高效表达重组蛋白VP3;并利用His标签纯化的方法得到高纯度的重组蛋白VP3;该蛋白在*** BL21细胞中以可溶性形式表达;VP3蛋白分子量大小为110 kDa,Western blot和间接免疫荧光鉴定结果表明重组蛋白VP3可与新型鹅细小病毒的特异单抗发生特异性免疫反应,表明原核表达的重组蛋白VP3具有良好的免疫原性,从而筛选出免疫效果好的单抗1-5和单抗1-7,这两种单抗可以高效鉴定NGPV,为以后开发ELISA诊断试剂检测NGPV奠定有利基础。根据NCBI基因库中VP3基因序列,对VP3基因的内部片段进行PCR扩增,得到分子量为143bp的VP3基因片段,以pMD19-T质粒为载体,成功构建重组质粒pMD19-143。将阳性质粒作为模板建立实时荧光定量PCR标准曲线、进行特异性检测、敏感性检测和重复性检测试验。研究结果表明,荧光定量的反应程序为:95℃预变性30 s;95℃变性5 s,60℃延伸34 s,40 cycles,上下游引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.8μmol/L时,荧光定量效果最佳。本研究建立的NGPV的荧光定量PCR的标准曲线的线性关系相关系数均在0.990以上;检测敏感性达到37.2拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高100倍,具有良好的特异性;批内和批间的重复性检测变异系数均小于2.2%,重复性好;因此利用荧光定量PCR方法检测新型鹅细小病毒,敏感性明显高于普通常规PCR方法。该方法具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可初步用于NGPV疫情的快速诊断。

关键词：新型鹅细小病毒鹅细小病毒原核表达荧光定量检测

新型鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染樱桃谷肉鸭的致病性研究

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新型鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染樱桃谷肉鸭的致病性研究

作者：李汉卿山东农业大学

学位级别：硕士

近年来,我国多个养鸭地区出现了以大舌、短喙、生长障碍为主要特征的新发疫病——“短喙侏儒”综合征(Short beak and dwaforsm syndrome,SBDS),该病主要引起雏鸭上下喙萎缩变短,舌头外伸、肿胀,进而引起采食困难,感染后期胫骨和翅骨易... 详细信息

近年来,我国多个养鸭地区出现了以大舌、短喙、生长障碍为主要特征的新发疫病——“短喙侏儒”综合征(Short beak and dwaforsm syndrome,SBDS),该病主要引起雏鸭上下喙萎缩变短,舌头外伸、肿胀,进而引起采食困难,感染后期胫骨和翅骨易发生骨折,腹泻、麻痹、体重明显低于健康鸭只,导致出栏合格率下降,对我国水禽养殖业造成较大的经济损失。研究人员通过病原分离与鉴定得到一种新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),但是将NGPV回归动物却很难复制出与自然感染相似症状的病例。后来流行病学调查发现患有SBDS病的鸭子中,鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)和NGPV混合感染的几率极高。由于禽类的圆环病毒感染所引起的临床症状与SBDS类似,因此DuCV被怀疑也是导致SBDS症状的病原之一。为了明确DuCV和NGPV混合感染能否协同导致SBDS以及二者之间的互相作用,本研究建立了两种病毒共感染的动物模型。本研究将200只健康1日龄樱桃谷肉鸭平均随机分为四组,将来自田间的DuCV YB03毒株和NGPV JS1123毒株通过口服的方式人工感染雏鸭,分为单独感染NGPV组、单独感染DuCV组、混合感染NGPV和DuCV组三个实验组,以及灌服生理盐水作为对照组,在1、3、7、14、21、28、35 DPI(Day post infection)随机选取六只剖杀并监测试验鸭体重、喙长、胫骨长度、临床症状、组织病变、血清学变化、拭子及各脏器的病毒载量等实验指标。研究发现攻毒后在雏鸭的咽喉拭子、肛门拭子以及血清中,NGPV和DuCV在试验验期间都能被检测到。所有攻毒组均出现羽毛凌乱、精神沉郁、发育迟缓、喜卧症状;生长抑制现象以混合感染组最为严重,其次为单独感染NGPV组,最后是单独感染DuCV组。单独感染NGPV组的病鸭还出现流涎、拉稀的症状,混合感染组的病鸭除了有这些症状之外,部分鸭还出现了短喙、舌肿胀、以及麻痹瘫痪的现象。解剖后发现混合感染组的脏器病变要比单独感染的两个组要严重,表现为肝脏质脆并呈现土黄色并伴有出血点、脾脏充血肿大、胸腺肿大并有出血点、肾脏和十二指肠均有出血点,单独感染DuCV组的胸腺有萎缩的症状,免疫器官指数显著性小于对照组(P病毒载量检测发现,DuCV和NGPV都有广泛的组织嗜性。总的来看,NGPV在病鸭体内的拷贝数要大于DuCV,并且混合感染组大部分脏器的DuCV病毒载量在前期高于单独感染DuCV组,而在后期低于单独感染DuCV组。本论文对新型鹅细小病毒与鸭圆环病毒共感染樱桃谷肉鸭的致病性进行了研究,发现NGPV和DuCV协同感染能够导致更严重的SBDS症状产生,为SBDS的深入研究与防治提供了重要理论依据。

关键词：新型鹅细小病毒鸭圆环病毒混合感染致病性短喙侏儒综合征

新型鹅细小病毒鸭胚传代毒全基因组序列分析及其感染性克隆的构建

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新型鹅细小病毒鸭胚传代毒全基因组序列分析及其感染性克隆的构建

作者：郝雪飘河北农业大学

学位级别：硕士

自2014年以来,我国江苏、山东、河北等地商品肉鸭群出现了以雏鸭发育迟缓,上下喙萎缩,舌头外伸、肿胀、向下弯曲为主要特征的疾病,俗称为“鸭短喙与侏儒综合征”(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS),给我国养鸭业造成了巨大经济损... 详细信息

自2014年以来,我国江苏、山东、河北等地商品肉鸭群出现了以雏鸭发育迟缓,上下喙萎缩,舌头外伸、肿胀、向下弯曲为主要特征的疾病,俗称为“鸭短喙与侏儒综合征”(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS),给我国养鸭业造成了巨大经济损失。该病的病原为新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),也称为鸭源鹅细小病毒、新型鸭细小病毒等。目前,决定NGPV毒力的关键基因和NGPV跨种传播的原因尚不明确。为获得一株NGPV减毒毒株,本研究将NGPV SD株在鸭胚上连续传至F50代,将F5代尿囊液与F50代尿囊液分别感染3日龄樱桃谷鸭进行致病性试验,观察感染后鸭的体重、喙长与排毒情况。与对照组相比,F5感染组体重在14 dpi时呈极显著差异,喙长在7 dpi时呈显著差异,14 dpi时呈极显著差异,在3 dpi时10只雏鸭均出现排毒;而F50感染组体重在14 dpi时呈显著差异,21 dpi时呈极显著差异,喙长在7 dpi时呈显著差异,14 dpi时呈极显著差异,在5 dpi时10只雏鸭均出现排毒;综上所述,与F5代相比,F50代毒力明显减弱。为探究影响NGPV毒力的基因位点,本研究对SD株F10、F20、F30、F40和F50进行了全基因组测序,经序列比对发现SD-F50突变的碱基位点涵盖了之前所有代次中突变的位点,将SD-F50与SD株进行碱基序列对比,发现在ITR区域中发生G26A、C61T、G320A、C355T突变,并于72、309位分别插入了碱基A和碱基T;在NS基F50与SD株的NS蛋白与VP蛋白氨基酸序列进行比较,在NS基因中,SD-F50相比较于SD株的突变为N225T,在VP基因,SD-F50相比较于SD株的突变为T465A、N703K;以上位点的改变或许会影响NGPV的毒力。为进一步探究这些突变位点与致病力之间的关系,本研究构建了 SD株的全长感染性克隆质粒。通过同义突变在基因组3807位引入遗传分子标记,消除Nco Ⅰ酶切位点,可后续用于区分拯救病毒与亲本病毒。将重组质粒同时转染鸭胚尿囊腔与卵黄囊途径拯救病毒,然后对其进行鉴定,将其命名为rSD。本研究通过对NGPV SD株传代株进行全基因组序列分析,发现SD株基因组序列在鸭胚传代过程中发生了一些适应性突变,这些突变或许与NGPV的致病性和NGPV对鸭的适应性有关,为NGPV毒力的关键基因的研究提供了参考依据。同时NGPV SD株感染性克隆的成功构建也可为NGPV毒力因素与跨种传播研究提供技术支持。

关键词：新型鹅细小病毒鸭短喙与侏儒综合征全基因组分析毒力基因感染性克隆

新型鹅细小病毒SD15株的分离鉴定及其增殖特性的研究

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新型鹅细小病毒SD15株的分离鉴定及其增殖特性的研究

作者：张锦玥四川农业大学

学位级别：硕士

本实验室对山东送检病的病鸭进行病原鉴定与病毒分离。通过PCR鉴定与基因测序,送检病料诊断为新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)感染,分离的病毒并命名为NGPV SD15株。以NS1和VP1基因构建分子遗传进化树,结果显示NGPV SD15... 详细信息

本实验室对山东送检病的病鸭进行病原鉴定与病毒分离。通过PCR鉴定与基因测序,送检病料诊断为新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)感染,分离的病毒并命名为NGPV SD15株。以NS1和VP1基因构建分子遗传进化树,结果显示NGPV SD15株与鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)在同一进化簇。以NGPV SD15株为接种物,肌注40只1日龄樱桃谷鸭,饲养6周,监控实验动物的体重、喙长。同时,收集心、肝、脾、肺、肾、十二指肠和直肠等组织,进行病毒拷贝数检测,并检测病理变化及病原的组织分布情况。从第3周后NGPV SD15株病毒感染的实验组鸭开始出现生长迟缓、腿部易骨折等症状,但没有明显的大舌症状。在感染6周后,感染组鸭的体重为1.80±0.22 kg,喙长为5.65±0.35 cm,对照组鸭的体重为2.21±0.26 kg,喙长为6.33±0.35 cm,感染组鸭的体重和喙长均极显著低于同时间的对照组鸭的体重和喙长。剖解并未发现组织内脏明显病变,用实时荧光定量(Real-time quality PCR,qPCR)方法对组织内病毒拷贝数进行检测,发现病毒含量在以上组织之间无明显差异。基于鼠抗NGPV多克隆抗体为一抗的免疫组织化学检测法(Immnohistochemistry,IHC)对病毒的组织分布进行观察,发现病原阳性信号均匀分布于以上组织中。组织病理观察发现感染组鸭的部分肝细胞轻度水肿,出现空泡变性,脾脏髓质区的脾小体减少甚至消失,淋巴细胞减少。将NGPV SD15接种9日龄鸭胚,盲传3代后NGPV SD15株病毒能在感染后48h-60 h致60%鸭胚死亡。尿囊液中病毒的拷贝数为10-10 copies/mL。将第4代NGPV SD15感染的鸭胚尿囊液接种50%汇合的鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast cells,DEFs)并盲传。盲传4代后NGPV能导致DEFs出现细胞病变(Cytopathic effect,CPE),细胞样品的病毒拷贝数为10-10 copies/mL。同样的方法接种鹅胚成纤维细胞(Goose embryo fibroblast cells,GEFs),发现NGPV SD15株病毒不能导致GEFs出现CPE,并且病毒拷贝数从10 copies/mL下降到10copies/mL。同时检测NGPV SD15株对DEFs的细胞毒性,发现感染96 h后NGPV对DEFs有明显的细胞毒性。以鼠抗NGPV多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA),检测NGPV SD15株第10代的病毒生长曲线。结果显示:在DEFs上,病毒阳性信号从72 h开始大量增加,96 h为最高峰。病毒增殖对数期在72-96 h,平台期在为96-120 h。同时,用PE Annexin V和7-Amino-Actinomycin双色染色法来观察NGPV SD15株致DEFs凋亡情况,发现NGPV主要引起感染细胞死亡,不诱导细胞凋亡。综上,本实验对临床分离的NGPV SD15株进行动物回归实验,初步研究了NGPV SD15株的在鸭体内分布情况及其临床病理变化。初步明确了NGPV体外增殖特性。本为NGPV的致病与增殖机制研究奠定基础。

关键词：新型鹅细小病毒分离鉴定增殖特性

鸭源新型鹅细小病毒YJDS-19-16株的分离鉴定及VP3基因序列分析

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中国动物检疫 2023年第7期40卷 17-23页

作者：何信群苏敬良徐玉李来旭李阁刘哲君李小意徐光菊田燕王灵强张晏何虹霞明月月重庆永健生物技术有限责任公司重庆402460 中国农业大学动物医学院北京100083

为了解鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)的生物学特性及遗传进化情况,将江苏省某鸭场送检的疑似发生鸭短喙侏儒综合征的鸭心脏、肝脏和脾脏等组织样品,经接种鸭胚分离病毒,对分离株进行ELD50测定、动物回归试验,并对其VP3基因进行遗传进化分析... 详细信息

为了解鸭源新型鹅细小病毒(NGPV)的生物学特性及遗传进化情况,将江苏省某鸭场送检的疑似发生鸭短喙侏儒综合征的鸭心脏、肝脏和脾脏等组织样品,经接种鸭胚分离病毒,对分离株进行ELD50测定、动物回归试验,并对其VP3基因进行遗传进化分析。分离鉴定结果显示:成功从送检的约17日龄樱桃谷鸭组织样品中分离到1株NGPV,将其命名为YJDS-19-16株;分离株YJDS-19-16 ELD50为10^(-5.7)/0.2mL,可引起试验鸭出现食欲不振、精神沉郁、采食量减少、生长发育不良和跛行等典型症状,并可成功复制出舌外露症状。构建的VP3基因遗传进化树显示,水禽细小病毒主要分为两个大支,经典番鸭细小病毒(MDPV)类为一支,经典鹅细小病毒(GPV)类为一支,且NGPV与GPV亲缘关系最近;VP3基因同源性分析结果显示:YJDS-19-16株与其他NGPV同源性为98.6%~99.9%,与经典GPV同源性为92.7%-96.1%;VP3蛋白氨基酸替换分析结果显示:第504位(S→R)为YJDS-19-16株独有。基因重组分析结果显示,YJDS-19-16株潜在的主要亲本和次要亲本分别为GPV 06-0329株和GDaGPV株,且重组可能分布于522~1060 bp。结果表明,引起鸭发生短喙侏儒综合征的分离株YJDS-19-16为鸭源NGPV,可能是一种重组病毒。本试验可丰富NGPV的研究资料,为水禽细小病毒遗传以及该病的诊断和预防等相关研究提供参考。

关键词：新型鹅细小病毒短喙侏儒综合征分离鉴定 VP3基因序列分析