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斯达氏油脂酵母肌动蛋白基因克隆及序列分析

生物技术通报 2009年第S1期25卷 280-283,299页

作者：唐伟谭海东张素芳赵宗保中国科学院大连化学物理研究所大连116023 中国科学院研究生院北京100049

以产油真菌斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi AS 2.1560)为材料,提取总RNA,反转录成cDNA。根据真菌肌动蛋白(actin)保守核酸序列设计引物,PCR扩增后获得部分序列,再采用cDNA末端快速扩增技术获得了开放阅读框全长为1128 bp的cDNA序列... 详细信息

以产油真菌斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi AS 2.1560)为材料,提取总RNA,反转录成cDNA。根据真菌肌动蛋白(actin)保守核酸序列设计引物,PCR扩增后获得部分序列,再采用cDNA末端快速扩增技术获得了开放阅读框全长为1128 bp的cDNA序列,该序列编码蛋白质含375个氨基酸残基,等电点为5.49。同源性比较发现该基因(Accession No. EU258762)与其它已知真菌的actin基因相似性在75%以上,氨基酸序列相似性在90%以上。通过不同物种肌动蛋白进化树分析发现***与亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)有较近的素缘关系。该研究对探索***产油机制有一定的参考价值。

关键词：斯达氏油脂酵母肌动蛋白 RNA提取 RACE 系统进化树

斯达氏油脂酵母2～#利用葡萄糖和木糖混合发酵产油脂的研究

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斯达氏油脂酵母2～#利用葡萄糖和木糖混合发酵产油脂的研究

作者：孔祥莉辽宁师范大学

学位级别：硕士

生物柴油是最重要的液体可再生能源产品之一,可以作为优质的化石能源代用品。油脂既是构成和维持生命活动的基本物质,也是重要的工业原料,可作为生物柴油,具有广泛的应用价值。目前油脂主要来源于动、植物,随着人们对微生物油脂研究的... 详细信息

生物柴油是最重要的液体可再生能源产品之一,可以作为优质的化石能源代用品。油脂既是构成和维持生命活动的基本物质,也是重要的工业原料,可作为生物柴油,具有广泛的应用价值。目前油脂主要来源于动、植物,随着人们对微生物油脂研究的不断深入,利用微生物发酵法获得油脂,可以缓解动、植物油脂资源紧缺的局面,而且产油微生物可以进行工、农业废弃物的资源化的再利用,从而为油脂资源开发提供了一条新的途径。木质纤维素资源来源丰富,是潜在的重要生物转化原料。木质纤维素水解得到同时含有葡萄糖和木糖等单糖的混合糖,在理想条件下,其葡萄糖含量约50%,木糖约25%,二者比例约为2:1。本论文以此为立题依据,对已筛选出的产油性能较好的菌株斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi 2利用混合糖发酵产油脂进行了研究,初步分析了斯达氏油脂酵母L. starkeyi 2分别以葡萄糖、木糖和混合糖为碳源发酵生产油脂的特性。*** 2分别利用70 g/L葡萄糖和70 g/L木糖作为碳源在30℃下摇瓶发酵96 h,糖利用率均达90%以上,菌体生物量分别为14.1 g/L和13.1 g/L,油脂含量分别为55.7%和52.6%。相同条件下该菌株利用混合糖(葡萄糖46 .6 g/L,木糖23.4 g/L)为碳源时总糖利用率、生物量和油脂含量分别为75.1%、15.0 g/L和40.0%。随后以葡萄糖和木糖(约2∶1)混合作为碳源,通过单因素实验并结合响应面的统计学方法优化了L. starkeyi 2菌株的混合糖产油发酵培养基的组成:混合糖浓度79.8 g/L、酵母粉浓度8.9 g/L、FeSO4浓度8.0 mg/L、KH2PO4浓度7 g/L、Na2HPO4浓度2 g/L、MgSO4浓度1 g/L、NH4Cl浓度0.5 g/L。经摇瓶培养,L. starkeyi 2生物量达到了18.0 g/L、油脂量为10.9 g/L、油脂含量达到了60.6%;在7 L发酵罐扩大培养中,生物量达到了27 g/L、油脂量达到了15.8 g/L、油脂含量达到了58.8%。

关键词：斯达氏油脂酵母混合糖微生物油脂产油酵母响应面方法

基于蛋白顺序提取法分析斯达氏油脂酵母的蛋白质组(英文)

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色谱 2011年第5期29卷 382-388页

作者：刘宏伟赵鑫程凯赵宗宝叶明亮中国科学院大连化学物理研究所中国科学院分离分析化学重点实验室国家色谱研究分析中心辽宁大连116023 中国科学院大连化学物理研究所生物质高效转化课题组辽宁大连116023

斯达氏油脂酵母能在细胞内合成大量的油脂,其细胞内的脂类物质影响着蛋白质提取和后续的蛋白质组学分析。常见的一步蛋白质提取法很难从含有大量油脂的斯达氏酵母细胞中提取蛋白质,因此其蛋白质组学分析的结果较差。本文发展了顺序提取... 详细信息

斯达氏油脂酵母能在细胞内合成大量的油脂,其细胞内的脂类物质影响着蛋白质提取和后续的蛋白质组学分析。常见的一步蛋白质提取法很难从含有大量油脂的斯达氏酵母细胞中提取蛋白质,因此其蛋白质组学分析的结果较差。本文发展了顺序提取法提取斯达氏酵母中的蛋白质,并采用在线多维微柱反相液相色谱-串联质谱联用技术分析其蛋白质组;共鉴定到227个高可信度的蛋白质,其数目是一步提取法的两倍;此外,所鉴定到的参与基础代谢的蛋白质数目比一步提取法也显著增加。此方法可以有效提取含大量油脂的物种中的蛋白质,为油脂积累的分子机制研究提供重要的信息。

关键词：在线多维微柱反相液相色谱-串联质谱样品前处理顺序提取蛋白质组分析斯达氏油脂酵母

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色醇对斯达氏油脂酵母产油能力的影响

微生物学通报 2008年第2期35卷 200-203页

作者：武双华艳艳仲崇斌赵宗保东北大学理学院生物技术研究所沈阳110004 中科院大连化学物理研究所生物技术研究部大连116023

研究在发酵培养基中添加色醇对斯达氏油脂酵母发酵的影响。结果表明,在接种后0h或12h时添加色醇,能够明显抑制菌体生长和油脂积累;而在培养24h或36h添加,能够明显促进菌体生长,并增强菌体对底物利用率。与对照组比较,在36h添加100μmol/... 详细信息

研究在发酵培养基中添加色醇对斯达氏油脂酵母发酵的影响。结果表明,在接种后0h或12h时添加色醇,能够明显抑制菌体生长和油脂积累;而在培养24h或36h添加,能够明显促进菌体生长,并增强菌体对底物利用率。与对照组比较,在36h添加100μmol/L色醇,生物量、油脂量和脂肪系数分别增加7.4%、13.9%和14.2%,发酵时间缩短13.3%,明显提高了油脂生产效率。气相色谱分析表明,添加色醇对菌油脂肪酸组成及其相对含量无显著影响。实验结果有助于建立调控油脂发酵的新策略,具有重要的理论和工程应用意义。

关键词：斯达氏油脂酵母微生物油脂色醇发酵

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斯达氏油脂酵母利用混合糖发酵产油脂

生物加工过程 2007年第2期5卷 36-41页

作者：孔祥莉刘波赵宗保冯斌辽宁师范大学生命科学学院大连116029 中科院大连化学物理研究所生物技术部大连116023

研究了斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi2#利用葡萄糖-木糖混合糖为碳源生长和油脂积累特性。***-keyi2#利用70 g/L葡萄糖和70 g/L木糖作为碳源在30℃下摇瓶发酵96 h,糖利用率均达90%以上,菌体生物量分别为14.1 g/L和13.1 g/L,油脂质... 详细信息

研究了斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi2#利用葡萄糖-木糖混合糖为碳源生长和油脂积累特性。***-keyi2#利用70 g/L葡萄糖和70 g/L木糖作为碳源在30℃下摇瓶发酵96 h,糖利用率均达90%以上,菌体生物量分别为14.1 g/L和13.1 g/L,油脂质量分数分别为55.7%和52.6%。相同条件下该菌株利用混合糖(葡萄糖46 g/L,木糖24 g/L)为碳源时总糖利用率、生物量和油脂质量分数分别为75.1%,15.0 g/L和40.0%。借助于P lackett-Burm an设计法和单因子实验法对培养条件进行了优化,结果表明发酵96 h混合糖利用率可达到97.3%,发酵120 h后混合糖利用率、生物量和菌体油脂质量分数分别达99.5%、19.0 g/L和52.6%。生物量得率和油脂得率分别达到27%和14%。

关键词：斯达氏油脂酵母混合糖微生物油脂产油酵母

过程整合强化斯达氏油脂酵母利用廉价原料产微生物油脂的研究

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过程整合强化斯达氏油脂酵母利用廉价原料产微生物油脂的研究

作者：苟庆玲武汉科技大学

学位级别：硕士

微生物油脂,尤其是产油酵母生产的油脂,其脂肪酸组成与动植物油脂相似,在生物柴油、食品添加剂、油脂化学品等领域具有光明的应用前景。产油微生物可以利用廉价的底物,如农业剩余物、粗甘油和工业废水废渣等生产微生物油脂。然而,当前... 详细信息

微生物油脂,尤其是产油酵母生产的油脂,其脂肪酸组成与动植物油脂相似,在生物柴油、食品添加剂、油脂化学品等领域具有光明的应用前景。产油微生物可以利用廉价的底物,如农业剩余物、粗甘油和工业废水废渣等生产微生物油脂。然而,当前微生物油脂生产技术存在着原料成本高、油脂产量低、工艺复杂等突出问题,极大地限制了其商业化生产。本论文结合斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560代谢各种复杂廉价原料的特性,通过过程整合技术,简化油脂生产工艺流程、减少酶成本和强化油脂积累,取得了以下研究成果:（1）首先采用三代测序技术,对*** AS 2.1560进行了全基因组测序和组装,得到21.4 Mb的基因组草图,其GC含量为46.87%。通过基因预测、同源性搜索和手工校对,注释了7378个蛋白编码基因,得到了斯达氏油脂酵母基因组注释数据库。围绕碳源代谢,对菌株水解、转运和代谢相关基因进行了生物信息学分析,预测了***利用廉价复杂原料产微生物油脂的潜力。（2）基于***含18个淀粉酶基因,探讨了***利用木薯淀粉统合生物加工生产微生物油脂的性能。当***以100 g/L淀粉为唯一碳源发酵144 h,油脂浓度高达18.3 g/L。菌株可以将淀粉酶分泌到胞外,胞外淀粉酶活力最高达3.65 U/mL。（3）基于***含13个纤维素酶基因,探讨了***无需外加β-葡萄糖苷酶的同步糖化油脂发酵性能。研究发现,同步糖化发酵过程中,纤维素被有效降解并转化为油脂,发酵过程中无纤维二糖积累,很好地规避了葡萄糖效应。发酵144 h,纤维素转化率、油脂浓度和油脂得率分别为92.4%,9.1 g/L和0.197 g/g。当同步糖化发酵体系中外加大量β-葡萄糖苷酶时,纤维素转化率、油脂浓度和油脂得率分别仅为89.6%,7.7 g/L和0.172 g/g。菌株产的葡萄糖苷酶主要分布于胞质,糖苷酶活力最高达475.8 U/L。此外,在同步糖化发酵之前引入预水解步骤可明显提高发酵初期发酵液中糖浓度,缩短发酵时间。

关键词：斯达氏油脂酵母木质纤维素木薯淀粉同步糖化油脂发酵统合生物加工

高产油脂斯达氏油脂酵母菌株选育及其发酵工艺研究

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高产油脂斯达氏油脂酵母菌株选育及其发酵工艺研究

作者：曲威辽宁师范大学

学位级别：硕士

油脂既是构成和维持生命活动的基本物质之一，也是重要的工业原料，具有广泛的应用价值。目前油脂资源主要来源于动植物，随着人们对微生物油脂的研究不断深入，利用微生物发酵法获得油脂，不但可以缓解动植物油脂资源紧缺的局面，而且... 详细信息

油脂既是构成和维持生命活动的基本物质之一，也是重要的工业原料，具有广泛的应用价值。目前油脂资源主要来源于动植物，随着人们对微生物油脂的研究不断深入，利用微生物发酵法获得油脂，不但可以缓解动植物油脂资源紧缺的局面，而且产油微生物可以进行废弃物的资源化再利用，为油脂资源的获得提供了一条新的途径。本论文以此为立题依据，通过对四株酵母菌斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)AS2.1560、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)As2.499、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)As2.1515和红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)As2.1609产油脂能力的比较研究，确定斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)AS2.1560是生产油脂的优良菌株;为了进一步提高其菌体生物量和菌体油脂量，以斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)AS2.1560为出发菌株，对其进行紫外线和氯化锂复合诱变，经过初筛和复筛，最后获得了一株油脂高产菌株MLS24。该突变菌株摇瓶培养96小时，生物量达18.2g/L，油脂量达10.8g/L，脂肪系数达16.1，均比出发菌株有明显的提高，连续传代多次，其产量性状无显著变化。试验表明突变菌株MLS24是一株极具有潜力改良成为工业化生产的菌株。随后，又以突变菌株MLS24为研究对象，考察了培养条件和培养基组成等发酵因子对MLS24发酵产油脂的影响。通过对各种因子的数量及配比进行了详细的研究，最后确定了MLS24摇瓶发酵的最佳培养条件：温度30℃，初始pH6.0，接种量15％，装瓶量50ml;最佳发酵培养基成分：葡萄糖110g／L，酵母粉0.1g／L，硫酸铵0.09g／L，磷酸二氢钾3g／L，硫酸镁1g／L，硫酸铜0.2μmol／L，硫酸锌0.2mmol／L，氯化锰0.2μmol／L。其生物量和油脂量分别达到了26.7g／L和15.6g／L。

关键词：斯达氏油脂酵母油脂诱变高产菌株发酵工艺

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油脂酵母利用粗甘油发酵产微生物油脂的研究

油脂酵母利用粗甘油发酵产微生物油脂的研究

作者：胡洋华南理工大学

学位级别：硕士

微生物油脂,又称单细胞油脂,具有与植物油脂相似的脂肪酸组成,是目前最具发展潜力的生物柴油油脂原料。但油脂微生物发酵采用的传统培养基成本过高,采用木质纤维素或工农业副产物为原料发酵产微生物油脂可有效降低其成本。粗甘油是生物... 详细信息

微生物油脂,又称单细胞油脂,具有与植物油脂相似的脂肪酸组成,是目前最具发展潜力的生物柴油油脂原料。但油脂微生物发酵采用的传统培养基成本过高,采用木质纤维素或工农业副产物为原料发酵产微生物油脂可有效降低其成本。粗甘油是生物柴油生产过程中的主要副产物,随着生物柴油生产规模的扩大,其量愈来愈大,对其有效回收利用成为生物柴油产业发展中必须解决的问题之一。利用粗甘油为培养基发酵产油脂,不仅可降低微生物油脂的生产成本,而且可以实现粗甘油的有效回收利用,因此,本课题对比研究不同油脂酵母利用粗甘油产油脂的情况,考察表面活性剂对其细胞生长和油脂积累的影响,并在5 L发酵罐中对发酵结果较好的油脂酵母进行扩大培养,建立相应的发酵动力学模型,为油脂微生物利用粗甘油发酵产油脂提供理论和实践依据。利用粗甘油为碳源考察了培养基组成和培养条件对发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)和斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)发酵产油脂的影响。对***、***和***而言,最适的甘油浓度分别为50 g/L、70 g/L和70 g/L。三种酵母菌进行油脂发酵适宜的氮源、碳氮比、接种量和pH分别为:酵母浸膏+蛋白胨、60、10.0%和6.0;而***、***和***最适培养温度分别为28oC、30oC和30oC。在优化条件下,***、***和***的最大生物量、油脂含量、油脂产率及油脂得率系数分别为16.04g/L、32.35%、5.19 g/L和0.16 g/g;17.35 g/L、32.15%、5.58 g/L和0.17 g/g以及21.06 g/L、35.70%、7.25 g/L和0.17 g/g。结果表明,三种酵母菌均可高效利用粗甘油产油脂,而与***和***相比,***利用粗甘油发酵产油脂时获得更高的生物量、油脂含量和油脂产率。进一步研究了粗甘油中存在甲醇时对三种酵母菌发酵产油脂的影响,发现当甲醇浓度高达14 g/L时,***、***和***的生物量和油脂含量无明显降低,可见,粗甘油中的甲醇未对油脂酵母的细胞生长和产物积累产生显著的抑制作用。因此,粗甘油是一种极具发展潜力的微生物油脂发酵培养基。为进一步提高酵母产油脂的能力,考察了表面活性剂(非离子、阳离子和阴离子表面活性剂)对三种酵母菌发酵产油脂的影响。研究发现在非离子表面活性剂中,Tween 80对三种酵母菌的细胞生长和油脂积累无明显影响。***和***的生物量和油脂含量随PEG-200浓度的增加而下降,而对于***,即使PEG-200的浓度高达0.5 g/L时,***的生物量和油脂含量亦无显著变化。有趣的是,虽然Brij 35对三种酵母菌的细胞生长有抑制作用,但却能促进油脂的积累。阳离子表面活性剂DTAB、TTAB和BC对***、***和***细胞生长和油脂积累均有显著的抑制作用,当其浓度为0.5 g/L时,酵母菌的生长完全停止。在阴离子表面活性剂中,SDS对三种酵母菌的细胞生长和油脂积累产生抑制作用;油酸钾对三种酵母菌的细胞生长无抑制作用,当其浓度为0.1 g/L时,能促进三种酵母菌的油脂积累;硬脂酸钠对***的细胞生长和油脂积累无显著影响,而0.1 g/L的硬脂酸钠能够增加***和***的油脂含量。采用5 L发酵罐对摇瓶发酵效果最好的***进行分批扩大培养。发现***的生物量、油脂含量及油脂产率均随着发酵时间的延长而增加,第10天时达到最大值,分别为29.21 g/L、42.93%和12.47 g/L。基于logistic、Lueeking-Piret和Luedeking-Piret-like方程构建了***在发酵罐中细胞生长、油脂积累和甘油消耗的动力学模型,结果表明***在粗甘油中最大比生长速率和油脂合成与菌体生长的相关系数分别为0.40和0.56。本研究对促进粗甘油在微生物油脂发酵中的应用,降低微生物油脂的生产成本具有重要意义。

关键词：微生物油脂粗甘油发酵性丝孢酵母皮状丝孢酵母斯达氏油脂酵母

淀粉统合生物加工与纤维素同步糖化发酵组合策略高产油脂的研究

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淀粉统合生物加工与纤维素同步糖化发酵组合策略高产油脂的研究

作者：赵漫武汉科技大学

学位级别：硕士

利用木质纤维素等廉价原料生产微生物油脂对解决当前我国面临的油源短缺问题具有重要意义。然而,目前木质纤维素制油脂技术路线存在着原料利用率低、工艺过程复杂、酶成本过高等突出问题,极大限制其商业化生产。本论文基于斯达氏油脂酵... 详细信息

利用木质纤维素等廉价原料生产微生物油脂对解决当前我国面临的油源短缺问题具有重要意义。然而,目前木质纤维素制油脂技术路线存在着原料利用率低、工艺过程复杂、酶成本过高等突出问题,极大限制其商业化生产。本论文基于斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560自产淀粉酶和β-葡萄糖苷酶的特性,探究淀粉材料的统合生物加工和纤维素材料的同步糖化发酵组合策略生产微生物油脂的可行性及优势,旨在通过过程整合显著简化生产工艺、降低酶成本和强化油脂生产效率。论文研究结果如下:(1)首先通过添加简单碳源或复杂碳源解决纤维素同步糖化发酵前期糖供应不足问题。发现添加可溶性淀粉,油脂量提高了90%。优化组合发酵培养基配方后,探讨了***在统合生物加工与同步糖化发酵组合策略下,载酶量为15 FPU/g,β-葡萄糖苷酶对发酵结果的影响,发现无需糖苷酶的额外添加,发酵120 h后,油脂产量和得率反而显著提升,分别达到16.28 g/L和0.20 g/g,能够显著降低酶成本。(2)进一步验证组合策略能强化纤维素同步糖化的油脂发酵后,对纤维素酶的添加量进行优化,选择5 FPU/g为最优载酶量。在40 g/L可溶性淀粉混合40 g/L纤维素的发酵中,淀粉能够在24 h内快速水解供糖。发酵144 h后,终点的油脂量为16.40 g/L,淀粉酶活力最高为3.55 U/m L。研究不同载酶量下碱预处理玉米秸秆酶水解效果以及其与木薯淀粉组合策略发酵产油效果,油脂生产强度最高达到3.88 g/L/d。最后,玉米秸秆和木薯淀粉的组合策略和单独统合生物加工及同步糖化发酵策略进行对比,结果表明组合策略在低载酶量下具有更强的协同效应。(3)基于***能快速利用淀粉从而在发酵前期提供大量可发酵性糖的特性以及使用的纤维素酶中糖苷酶酶活力低的特点,探讨了高浓度淀粉和纤维素降解底物(葡萄糖,纤维二糖,麦芽糖和糊精)培养基和高浓度组合培养基中***的产油情况。当浓度设定在80 g/L到200 g/L之间,随着底物浓度的升高,生物量和油脂量总体呈下降趋势,其中葡萄糖培养基中下降的趋势最明显。等碳摩尔量下,二糖和寡糖的培养基中酵母的产油效果优于单糖,单体产生的底物抑制强于多聚物,高分子聚糖有利于实现高底物发酵,为后续高底物分批补料提供研究基础。

关键词：斯达氏油脂酵母统合生物加工同步糖化发酵高底物浓度生物柴油