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基于RNAi技术的中华豆芫菁HMGR基因与斑蝥素生物合成关系的研究

基于RNAi技术的中华豆芫菁HMGR基因与斑蝥素生物合成关系的研究

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作者：霍棠西北农林科技大学

学位级别：硕士

斑蝥素(Cantharidin,C10H12O4)是以鞘翅目(Coleopera)芫菁科(Meloidae)昆虫为主产生的一种萜类毒素,因其对生物体内部分生物活性能产生抑制作用而在医药和植保领域受到高度重视,具有极高的利用价值,但斑蝥素的生产是其应用的瓶颈,因此,... 详细信息

斑蝥素(Cantharidin,C10H12O4)是以鞘翅目(Coleopera)芫菁科(Meloidae)昆虫为主产生的一种萜类毒素,因其对生物体内部分生物活性能产生抑制作用而在医药和植保领域受到高度重视,具有极高的利用价值,但斑蝥素的生产是其应用的瓶颈,因此,明确斑蝥素在芫菁体内的生物合成途径对其资源开发具有极为重要的意义。大量研究证实,昆虫萜类物质生物合成途径是甲羟戊酸(Mevalonic acid,MVA)途径,而且3-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroy-3-methyl-glutary-CoA,HMGR)是其关键限速酶。本研究以中华豆芫菁Epicauta chinensis为研究对象,通过体外合成靶基因HMGR的dsRNA,用注射法将dsRNA导入虫体进行干扰,并使用相对实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测干扰后HMGR mRNA的表达水平,同时使用气相色谱(Gas chromatography,GC)内标法检测同一试虫的斑蝥素含量。分析HMGR mRNA被成功干扰后对芫菁体内斑蝥素合成的影响,推断HMGR基因与斑蝥素生物合成的关系。为了选择可靠的相对实时定量内参基因,本研究采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cDNA序列,并使用生物信息学软件进行序列分析;采用real-time PCR检测β-actin在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种组织以及注射刺激和非刺激条件下mRNA的表达量,进而验证β-actin基因在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。主要研究结果如下:1.克隆得到中华豆芫菁β-actin基因全长1673 bp,其中5’非编码区88 bp,3’非编码区455 bp,编码376个氨基酸,推测的蛋白分子量约为41.81 ku,理论等电点为5.09,该氨基酸序列与其他昆虫β-actin序列一致性可达97%～99%;Real-time PCR结果显示,β-actin mRNA在中华豆芫菁不同组织及注射刺激与非刺激条件下表达量无显著差异。说明该基因可作为中华豆芫菁试虫相对实时定量PCR研究中的可靠内参基因。该基因全长cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。2.测得中华豆芫菁雄虫交尾后0、1、2、3、4、5和7 d体内斑蝥素含量的变化及HMGR mRNA的相对表达量,结果显示刚结束交尾时雄虫体内斑蝥素含量很低,随时间变化呈现不断上升的趋势,因此可以确定雄虫在交尾结束后合成了斑蝥素;而且在斑蝥素含量上升的过程中有两个高峰期,即从交尾结束至第3天和从第5天到第7天。此外,real-time PCR结果显示HMGR mRNA在雄虫交尾后的表达量与斑蝥素含量随时间变化的趋势一致,均在刚结束交尾后有一个持续大量表达的过程,相关性分析发现二者存在着极显著的正相关关系(r=0.891)。这为后续的干扰实验奠定了基础,并将干扰的注射时间确定为结束交尾第0天的时刻。3.采用显微注射RNAi方法干扰中华豆芫菁体内HMGR mRNA的表达,结果发现在干扰后第2天,处理组(注射HMGR dsRNA)与对照组(注射GFP dsRNA、RNase-free H2O和空白对照)相比,HMGR mRNA表达量明显降低,仅为对照的10%左右,并一直持续于低水平,而对照组HMGR mRNA的表达量随时间变化逐渐增高,到第7天处理组的表达量不足对照组的5%。统计分析表明各个时间段处理组和对照组之间差异极显著,而三个对照组之间差异极不显著。说明注射HMGR dsRNA成功干扰了 HMGR mRNA的表达。同时检测同一试虫的斑蝥素含量,统计分析表明,干扰后前3天注射HMGRdsRNA的处理组与3组对照组之间没有显著性差异;从第5天开始,对照组斑蝥素含量持续上升,而处理组斑蝥素的合成受到了明显的抑制,含量约为对照的30%,到第7天斑蝥素含量不足对照的25%,与对照组差异显著。而各个时间段3个对照组之间无显著性差异。说明通过注射HMGR dsRNA成功干扰芫菁体内HMGR mRNA的表达后,芫菁体内斑蝥素的合成明显受到了抑制。本研究首次基于RNAi方法研究芫菁体内HMGR基因与斑蝥素合成的关系,成功建立了一套在芫菁体内进行RNAi研究的技术体系。实验结果表明,通过注射RNAi方法成功干扰了芫菁体内HMGR mRNA的表达,并在干扰后导致斑蝥素合成明显受阻。而HMGR是MVA途径的关键限速酶,因此可推测芫菁体内斑蝥素的生物合成可能通过MVA途径。研究结果为芫菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径的进一步探索奠定了基础。

关键词：中华豆芫菁斑蝥素生物合成 MVA途径 HMGR基因 β-actin基因

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大斑芫菁基因组测序及其斑蝥素合成相关基因研究

大斑芫菁基因组测序及其斑蝥素合成相关基因研究

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作者：段雷陕西师范大学

学位级别：硕士

大斑芫菁(Mylabris phalerata)俗称南方大斑蝥,是《中华人民共和国药典》中记录的药用昆虫之一。本研究采用第三代测序技术(Pac Bio)和染色体测序技术(Hi-C),获得了大斑芫菁的染色体级别的参考基因组;测定了其头、胸、腹三个部分的转录... 详细信息

大斑芫菁(Mylabris phalerata)俗称南方大斑蝥,是《中华人民共和国药典》中记录的药用昆虫之一。本研究采用第三代测序技术(Pac Bio)和染色体测序技术(Hi-C),获得了大斑芫菁的染色体级别的参考基因组;测定了其头、胸、腹三个部分的转录组;并分析了其斑蝥素合成相关通路和基因的演化,以便为后续深入挖掘斑蝥素的合成和演化机制提供了支撑。主要结果如下:1.本研究获得了一个129.79Mb的高质量染色体级别的大斑芫菁参考基因组,共包含11条染色体,contig N50为5.95Mb,核基因完整性(BUSCO)为99.5%。这个参考基因组包含了37.5Mb的重复序列和一个包含15,858条蛋白质编码序列的基因集。对这个基因集在Swiss-prot、interproscan、GO、KEGG、KOG和Pfam数据库中进行注释,有至少14,353条基因得到了注释,并找到了与斑蝥素合成相关的17种38条基因。2.本研究利用illumina测序得到了大斑芫菁头、胸、腹三个部位的转录组数据,分别有16.32Gb,15.38Gb和14.4Gb。这些数据不仅用于修正组装的参考基因组,还分析了不同部位间的基因表达量差异(FPKM)。结果显示,腹部与头部和胸部相比,分别有902和631条基因显著表达上调,上调的基因除了与活跃的细胞代谢相关外,有机环状、杂环状和芳香环状化合物的代谢也有高表达现象。结合所鉴定到的斑蝥素合成相关基因在三个部位中的差异表达,可以确定斑蝥素的合成是一个复杂的多部位协作的过程,但主要合成位置是在腹部。3.利用Orthofinder软件,本研究找到了大斑芫菁14,291条直系同源基因,其中有2,486条基因发生了基因复制现象以及147条异同源基因。CAFé软件找到了691个扩张的直系同源基因家族和1,272个收缩的直系同源基因家族。基于单拷贝同源序列的建树结果,推测芫菁科分化的时间在28Mya以前,在该时间点,豆科物种大规模产生,芫菁科适应生存环境而分化出来。4.结合已鉴定到的17种斑蝥素合成相关基因及其参与的6条代谢通路,确定了28条共同参与萜类骨架合成和昆虫激素生物合成的基因,在这28条基因中有23条都是DHRS11基因的多拷贝。这些基因不仅有着相同的核心结构域,在转录组中表达了18条,并且主要参与了法尼醇与法尼酸的转化通路和催化法尼酸合成下游保幼激素的通路。DHRS11基因属于短链脱氢酶还原酶家族,广泛存在于动物界中,该基因对哺乳动物体内的甾醇等萜类化合物具有广泛的底物特异性,并在萜类化合物代谢发挥关键作用。我们推测DHRS11基因在斑蝥素合成中起着关键的作用,但其具体的作用机制还需进一步研究。本论文组装了大斑芫菁染色体水平的基因组,是目前完整度最好的芫菁科昆虫基因组。同时发现了比较完整的斑蝥素合成通路,能够为斑蝥素的生物合成提供重要的理论支撑。

关键词：大斑芫菁染色体水平基因组转录组斑蝥素生物合成 DHRS11基因

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