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E3泛素连接酶接头蛋白SPOP抑制前列腺癌细胞CCL2表达的机制研究

E3泛素连接酶接头蛋白SPOP抑制前列腺癌细胞CCL2表达的机制研究

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作者：焦寒广西医科大学

学位级别：硕士

目的和意义:探讨斑点状锌指结构蛋白(Speckle type POZ protein,SPOP)作为E3泛素连接酶接头蛋白在前列腺癌细胞C4-2和LNCa P中对单核细胞趋化蛋白1(macrophage chemoattractant protein-1,又称Chemotactic Cytokines ligand 2,CCL2)水平的影响,探索SPOP抑制CCL2表达的可能机制,为前列腺癌的早期诊断和靶向治疗提供实验依据和理论基础。方法:Western Blot和Real-time PCR检测SPOP和CCL2在不同前列腺癌细胞系的表达情况。慢病毒稳定转染构建干扰SPOP表达的C4-2和LNCa P细胞系,通过Western Blot、Real-time PCR和ELISA技术分别检测溴结构域蛋白4(Bromodomain Containing 4,BRD4)蛋白水平、CCL2 m RNA和蛋白分泌水平。Western Blot技术和ELISA检测过表达突变SPOP的前列腺癌细胞C4-2中BRD4蛋白表达及CCL2蛋白分泌水平的变化。Western Blot技术和ELISA检测过表达突变SPOP的前列腺癌细胞LNCa P中BRD4蛋白表达及CCL2蛋白分泌水平的变化。脂质体瞬转构建过表达SPOP的C4-2和LNCa P细胞系,Western Blot技术检测BRD4蛋白水平的变化情况。Transwell和划痕实验检测干扰SPOP对前列腺癌细胞C4-2和LNCa P的迁移和侵袭能力的影响。细胞免疫荧光技术观察TNF-α刺激后干扰SPOP的前列腺癌细胞NF-κB通路相关蛋白p-p65在细胞中定位的变化。结果:Western Blot和Real-time PCR结果显示SPOP蛋白在C4-2细胞中表达最高,CCL2 m RNA在LNCa P细胞中表达最高。Western Blot、Realtime PCR和ELISA结果显示SPOP在前列腺癌细胞C4-2和LNCa P中负调控BRD4和CCL2的表达。ELISA结果显示SPOP突变对CCL2的蛋白分泌水平无明显抑制作用。瞬时干扰BRD4或使用BET蛋白抑制剂JQ1处理可逆转干扰SPOP导致的CCL2上调。Transwell和划痕实验结果显示敲低SPOP的前列腺癌细胞C4-2和LNCa P细胞迁移和侵袭能力增加。Western Blot结果显示在敲低SPOP的前列腺癌细胞C4-2和LNCa P细胞中使用TNF-α刺激后NF-κB通路相关蛋白显著上升。细胞免疫荧光技术观察到TNF-α刺激前列腺癌细胞C4-2和LNCa P后p-p65表达水平明显增加。结论:SPOP在人前列腺癌细胞中通过调控BRD4蛋白表达,抑制NF-κB通路,从而负调控CCL2表达,抑制细胞迁移和侵袭能力,发挥抑癌基因的作用。

关键词：斑点状锌指结构蛋白单核细胞趋化蛋白1 前列腺癌 NF-κB通路

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