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四川师范大学学报（自然科学版） 2015年第1期38卷 126-133页

作者：任尧程世君马彩虹王薇伊唐明李维葛方兰陈贵英四川师范大学生命科学学院四川成都610101

胆固醇是某些病原菌胞内生存所必需的碳源和能源物质,而胆固醇的各种代谢酶是潜在的药物作用靶点.烯酰辅酶A水合酶主要参与了脂肪酸的β-氧化循环,但其在胆固醇降解中的作用机理尚不完全清楚.首先对耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmati... 详细信息

胆固醇是某些病原菌胞内生存所必需的碳源和能源物质,而胆固醇的各种代谢酶是潜在的药物作用靶点.烯酰辅酶A水合酶主要参与了脂肪酸的β-氧化循环,但其在胆固醇降解中的作用机理尚不完全清楚.首先对耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis MC2155)进行了全基因组搜索,获得了18个烯酰辅酶A水合酶的候选基因.对在不同甾醇类化合物条件下的转录组测序结果进行了分析,发现18个候选基因差异表达明显,其中位于胆固醇降解基因簇中的MSMEG_5915(ech A19),在胆固醇条件下表达明显上调,MSMEG_5915(ech A19)可能参与了胆固醇的侧链降解.最后,构建了MSMEG_5915的敲除质粒,并对耻垢分枝杆菌进行了基因转化.经PCR快速分子鉴定,MSMEG_5915基因被同源整合于耻垢分枝杆菌染色体上.为进一步揭示MSMEG_5915(ech A19)基因的功能奠定了基础.

关键词：耻垢分枝杆菌烯酰辅酶A水合酶转录分析敲除质粒电转化

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弓形虫热休克蛋白(Hsp90)敲除质粒及过表达质粒的构建与鉴定

弓形虫热休克蛋白(Hsp90)敲除质粒及过表达质粒的构建与鉴定

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中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：孙洪超卓洵辉杨怡郭筱璐阳毅敏蓝丽华陈学秋杜爱芳浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室

弓形虫热休克蛋白(Hsp90)作为一种伴侣蛋白分子,参与多种细胞信号转导通路,为探索其生物学功能,本研究构建弓形虫Hsp90基因敲除转染质粒(Hsp90-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript)及过表达质粒(SAG1-Hsp90-pTCY),为后续实验奠定基础。根据... 详细信息

弓形虫热休克蛋白(Hsp90)作为一种伴侣蛋白分子,参与多种细胞信号转导通路,为探索其生物学功能,本研究构建弓形虫Hsp90基因敲除转染质粒(Hsp90-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript)及过表达质粒(SAG1-Hsp90-pTCY),为后续实验奠定基础。根据ToxoDB数据库中公布的TgHsp90基因序列,设计并合成三对特异性引物,利用PCR技术特异扩增TgHsp90基因的5’非翻译区(5’UTR)、3’非翻译区(3’UTR)、Hsp90编码区(Hsp90-CDS),将其分别亚克隆入pMD-18T载体中。将重组质粒5’、3’/UTR/TA亚克隆入转染质粒pBLE-pBluescript中,构建敲除质粒Hsp90-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript:将重组质粒Hsp90-CDS/TA亚克隆入转染质粒pTCY(SAG1-CAT-YFP)中,构建过表达质粒Hsp90-pTCY。经DNA测序分析,成功获得Hsp90 5’UTR、3’UTR片段,大小为1 796bp、1 773bp;Hsp90-CDS片段经DNA测序分析,成功获得该片段,大小为2127bp;重组质粒Hsp90 3’UTR/TA、Hsp90-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript、SAG1-Hsp90-pTCY经HindⅢKpnⅠ、NotⅠ和SpeⅠ、HindⅢEcoRⅠ双酶切鉴定,得到大小约为1700bp、1700bp、2100bp左右的目的条带,酶切鉴定结果均与预期结果相符;以上实验结果显示成功构建了弓形虫Hsp90敲除质粒及过表达质粒,为研究Hsp90基因特性提供基础。

关键词：弓形虫 Hsp90 敲除质粒过表达质粒

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弓形虫蛋白激酶(TgPKA)调控虫体增殖的初步研究

弓形虫蛋白激酶(TgPKA)调控虫体增殖的初步研究

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全国寄生虫病高峰论坛暨2016年浙江省热带病与寄生虫病...

作者：孙洪超卓洵辉阳毅敏蓝丽华陈学秋杨怡郭筱璐杜爱芳浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室

弓形虫cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)是一种在弓形虫无性生殖阶段表达的蛋白激酶,参与多种细胞信号转导通路,为探索其生物学功能,本研究构建弓形虫PKA基因(TgPKA)敲除转染质粒(PKA-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript),并利用腐草霉素进行筛选。... 详细信息

弓形虫cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)是一种在弓形虫无性生殖阶段表达的蛋白激酶,参与多种细胞信号转导通路,为探索其生物学功能,本研究构建弓形虫PKA基因(TgPKA)敲除转染质粒(PKA-5’UTR-3’UTR-PBLE-pBluescript),并利用腐草霉素进行筛选。经DNA测序分析,成功获得TgPKA-5’UTR、3’UTR片段,大小为1943bp、1891bp;重组质粒PKA-5’UTR-3’UTR-PBLEpBluescript经ApaⅠ和HindⅢ、NotⅠ和SpeⅠ双酶切鉴定,得到大小约为1900bp、1800bp左右的目的条带,酶切鉴定结果与预期相符,成功构建了弓形虫PKA敲除质粒;利用腐草霉素进行筛选,经PCR等技术鉴定证明成功获得弓形虫PKA敲除虫株(△TgPKA);应用间接免疫荧光实验(IFA)检测TgPKA缺失后弓形虫粘附、入侵细胞的能力。粘附实验结果表明,缺失PKA基因后,弓形虫粘附宿主细胞的能力无明显变化,表明该基因可能不直接参与虫体粘附细胞的过程。入侵实验结果表明,缺失PKA基因,弓形虫入侵细胞的能力变弱,提示TgPKA基因可能参与弓形虫的入侵过程。荧光定量PCR(QRT-PCR)、IFA等实验结果显示,△TgPKA组虫体增殖速度与野生株组相比明显减慢,揭示该基因在弓形虫增殖过程中具有重要的作用,为深入研究该基因功能提供思路。

关键词：弓形虫 PKA 敲除质粒缺失株增殖

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