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效应物对辣椒过氧化物酶活性和稳定性的影响

太原理工大学学报 2017年第4期48卷 576-581页

作者：杨文英靳利娥太原理工大学体育学院太原030024 太原理工大学化学化工学院太原030024

为了提高辣椒过氧化物酶(chilli peroxidase,CH-POD)的活力和稳定性,在辣椒中提取的CH-POD中分别加入硫酸锌(zinc sulfate,ZS)、葡萄糖酸锌(zinc gluconate,ZG)、乙酸锌(zinc acetate,ZA)等锌效应物和D-山梨醇(D-sorbitol,D-SOR)、D-甘露醇(D-mannitol,D-MAN)等糖效应物,考察上述效应物对CH-POD活力的影响,选出最佳效应物。通过化学动力学确定了最佳效应物存在下CH-POD失活速率与储存时间之间的关系,并研究了效应物对酶Zeta电位的影响。结果表明,上述效应物均可提高CH-POD的活性,由ZA和D-SOR所组成的二元效应物(ZA-DSOR)为最佳效应物;ZA-D-SOR的加入增强了CH-POD的热稳定性,延长了储存半衰期,提高了Zeta电位稳定性。

关键词：过氧化物酶活性酶稳定性效应物乙酸锌 D-山梨醇

效应物对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

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效应物对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）N-乙酰-β-D-氨基葡萄...

作者：陈宏惠福建农林大学

学位级别：硕士

以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)内脏为材料，通过0.01mol·L Tris-HCI缓冲液(pH 7.5含0.2mol·L NaCl，5％乙醇)抽提处理，硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose(DEAE-32)离子交换柱、Sephadex G-100分子筛、第二次DEAE-32离子交换柱3次层析纯化，获得比活力为4490.79U／mg的电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase，EC3.***.1.52)。该酶亚基分子量分别为121.21、98.63和73.48 kD，等电点为4.5。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物，测得该酶在0.2mol·L磷酸缓冲液(pH5.6)中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.5，最适温度为45℃;该酶在低于45℃，pH 4.9-9.3范围内稳定。在pH5.6的条件下，酶水解pNP-NAG的米氏常数K为0.357mmol·L，最大反应速度V为10.409umol·L·min，反应的活化能为76.50KJ／mol。研究几种有机溶剂对该酶活力的影响。结果表明：甲醇和乙醇对酶有先扬后抑作用，正丙醇、异丙醇、甲醛、丙酮、苯酚和二甲亚砜对酶的活性均有不同程度的抑制作用。甲醇、乙醇和异丙醇对酶的抑制类型都为可逆竞争性抑制类型，它们对酶的抑制常数K分别为3.66mol·L、0.36mol·L和0.48mmol·L。甲醛、苯酚和二甲亚砜对酶的抑制类型属于可逆非竞争性抑制类型，它们对酶的抑制常数K分别为0.288mol·L、0.268mmol·L和0.276 mol·L。正丙醇、丙酮对酶的抑制类型为可逆混合型抑制类型，正丙醇对酶的抑制常数K与K分别为3.14mmol·L和9.35mmol·L，丙酮对酶的抑制常数K与K分别为0.195mol·L和0.620 mol·L。戊二醛对酶活力没有影响。研究金属离子对该酶的影响，结果表明：Na对酶有激活作用，Ba、Ag对酶活力有先扬后抑作用。Li和K对酶有微弱的抑制作用，Mg、Cu、pb、Zn、Mn和Al对酶活力有不同程度的抑制作用。Mg、Cu和Zn对酶的抑制均表现为可逆非竞争性抑制类型，它们对酶的抑制常数K分别为0.704mol·L、1.25mmol·L和8.10mmol·L。Ag对酶的抑制作用为可逆反竞争性抑制类型，Ag对结合酶(ES)的抑制常数K为204.508mmol·L。pb对酶的抑制表现为可逆混合型抑制，pb对酶的抑制常数K与K分别为10.44mmol·L和2.217mol·L。Ca对酶活力没有显著影响。研究12种氨基酸对该酶的影响。结果表明：在特定浓度范围内，L-Gly、L-Val、L-Thr、L-Ala、L-Phe和L-Ser等氨基酸对酶活力没有显著影响，而L-Gln、L-Met、L-Pro、L-Arg、L-His和L-Lys对河蟹NAGase有不同程度的抑制作用。L-Pro对酶的抑制表现为可逆非竞争性类型，L-Pro对酶的抑制常数K为702.87mmol·L。L-Arg、L-His和L-Lys对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型，它们对酶的抑制分别为1.682mmol·L、85.81mmol·L和1.517mmol·L。水体中的富营养化产生的SO对该酶活力有抑制作用，抑制类型为可逆反竞争性类型，50对酶的抑制常数K为253.995mmol·L。NO在0-10mmol·L范围内对酶活力有激活作用。研究过氧化氢对该酶的影响，结果表明，过氧化氢对酶有抑制作用，抑制类型为可逆反竞争性类型，过氧化氢对结合酶(Es)的抑制常数K为136.78mmol·L。研究尿素对酶的影响，结果表明，尿素对酶活力有抑制作用，尿素对酶的抑制属于可逆混合型抑制类型，尿素对酶的抑制常数K与K分别为379.02mmol·Lsub>-1和1.182mol·L。

关键词：中华绒螯蟹 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶分离纯化性质效应物

文昌鱼ALPase底物特异性及其效应物对酶活力的影响

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厦门大学学报（自然科学版） 1989年第1期28卷 92-96页

作者：陈清西颜思旭厦门大学生物学系

研究了文昌鱼碱性磷酸酶的底物特异性,测定酶催化几种单核苷酸和磷酸酯化合物水解反应的Kcat/Km值,酶对单核苷酸的新和力大小依次为3’-AMP>3’-UMP>3’-CMP>3’-GMP=2’-AMP>ε-AMP>5’-CMP>5’-AMP,研究效应物对酶水解对-硝基苯磷酸... 详细信息

研究了文昌鱼碱性磷酸酶的底物特异性,测定酶催化几种单核苷酸和磷酸酯化合物水解反应的Kcat/Km值,酶对单核苷酸的新和力大小依次为3’-AMP>3’-UMP>3’-CMP>3’-GMP=2’-AMP>ε-AMP>5’-CMP>5’-AMP,研究效应物对酶水解对-硝基苯磷酸的影响表明:无机磷酸盐、砷酸盐为竞争性抑制,L-?丙氨酸为反应竞争性抑制,L-半胱氨酸、二巯基苏糖醇为混合型抑制;并测定于它们的抑制常数。

关键词：文昌鱼碱性磷酸酶特异性效应物

效应物对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制作用研究

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效应物对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制作用研究

作者：杨学敏厦门大学

学位级别：硕士

以青蟹内脏为材料,分离提纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase),获得比活力为7,990 U/mg的PAGE和SDS-PAGE电泳单一纯的酶制剂。本文以此酶制剂为对象展开以下几方面的研究。 (1)金属离子对酶活力的影响:结果表明,一价金属离子中的Li、N... 详细信息

以青蟹内脏为材料,分离提纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase),获得比活力为7,990 U/mg的PAGE和SDS-PAGE电泳单一纯的酶制剂。本文以此酶制剂为对象展开以下几方面的研究。 (1)金属离子对酶活力的影响:结果表明,一价金属离子中的Li、Na和K对酶活力没有明显影响,而Ag+对该酶有较强的抑制作用(IC为2.32 mmol/L)。二价金属离子中Mg、Ca、Ba、Co和Mn对该酶都有激活作用,其中Mg、Ca和Ba的激活作用较强,其强度依次为Ca >Ba >Mg,而Mn对酶仅有轻微的激活作用,Co对酶的效应则是先激活后抑制。Cd、Pb和Hg对该酶有不同程度的抑制作用,Cd和Pb对酶的抑制表现为可逆过程,Cd和Pb对酶的抑制作用属于混合型,Cd的抑制常数KI和KIS分别为23.9和5.0 mmol/L,Pb的抑制常数KI和KIS分别为0.70和6.22 mmol/L。Hg对酶的抑制作用是不可逆的。应用荧光发射光谱研究Pb和Hg对酶分子构象的影响,比较酶构象与酶活力的关系,发现Pb、Hg使酶活力的变化快于构象的变化。采用邹氏方法研究Pb对酶的抑制作用动力学,建立动力学模型,测定抑制剂与游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)结合的微观速度常数,并加以比较,表明底物对酶的抑制作用有明显的保护作用。三价金属离子Al、Fe对该酶均表现为可逆的抑制作用,Fe对酶的抑制作用属于混合型,Fe的抑制常数KI和KIS分别为395.5和135.6μmol/L。 (2)有机溶剂对酶的效应:酶在醇类、醛类、酮类、甲酰胺类等有机溶剂中均表现为可逆的抑制作用。醇类物质中甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇和丙三醇对酶的抑制作用属于竞争性(KI分别为1.20、0.49、1.69、1.32、1.27 mol/L)。醛类物质中甲醛对酶的抑制为非竞争性抑制(KI为0.608 mol/L),而苯甲醛对酶的抑制属于竞争性(KI为0.012 mol/L),进一步研究甲醛对酶的失活作用动力学,建立了动力学模型,测定抑制剂与游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)结合的微观速度常数,表明在甲醛存在下,底物对酶的抑制作用有明显的保护作用。酮类物质中丙酮对酶产生混合型抑制(KI和KIS分别为0.406和1.049 mol/L),而环己酮对酶的抑制属于竞争性(KI为1.33 mol/L),应用荧光发射光谱研究丙酮对酶分子构象的影响,结果显示丙酮对酶分子构象有显著的影响。甲酰胺物质中甲酰胺对酶的抑

关键词：锯缘青蟹 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶效应物抑制作用

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野油菜黄单胞菌效应物转运鉴定系统的构建

野油菜黄单胞菌效应物转运鉴定系统的构建

作者：韦红玉广西大学

学位级别：硕士

效应物是通过Ⅲ型分泌系统转运至植物或动物细胞内，起识别或致病作用的细菌分泌蛋白，对于病原菌的致病性至关重要。效应物蛋白从结构上可分为分泌转运信号区和互作功能区。目前，在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestr... 详细信息

效应物是通过Ⅲ型分泌系统转运至植物或动物细胞内，起识别或致病作用的细菌分泌蛋白，对于病原菌的致病性至关重要。效应物蛋白从结构上可分为分泌转运信号区和互作功能区。目前，在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris ***，Xcc)中仍然缺乏有效、快速的鉴定致病效应物的方法。为有效地在全基因组水平上鉴定Xcc效应物，本研究依据黄单胞菌的avrBsl对辣椒ECW-10R的Bsl互作机理，建立了一套快速、有效地Xcc效应物转运鉴定系统。首先，构建了Xcc avrBsl的缺失突变体，证明avrBsl基因所编码的无毒蛋白能引起具Bsl抗性基因的辣椒ECW-10R过敏性反应(hypersensitive reaction，HR)。然后，通过缺失AvrBsl N端氨基酸实验，预测avrBsl第59至445氨基酸为能引起HR反应的AvrBsl功能区，农杆菌介导瞬时表达证明Xcc avrBsl第59至445氨基酸足够诱导ECW-10R HR反应，鉴定为Xcc avrBs，的互作功能区。利用Xcc avrBsl，的互作功能区，分别与X00241、XC3160的启动子区和信号区融合，结果能引起依赖hrp-TTSS的HR反应。GUS活性检测表明这两个基因都受到hrpG和hrpX调控，致病力试验表明这两个基因都与致病相关。通过该系统，X00241、X03160被鉴定为新的效应物基因，表明该鉴定系统能有效工作。

关键词：效应物 III型分泌系统野油菜黄单胞菌 avrBs1 转运鉴定系统

镧、钕对小麦和油菜酶活性及体内效应物的研究

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镧、钕对小麦和油菜酶活性及体内效应物的研究

作者：王健安徽农业大学

学位级别：硕士

中国稀土农用的研究始于20世纪70年代,,通过大量的农业科研与田间试验,证实了适量的稀土有促进农作物增产以及改善品质等效果,但稀土农用是如何产生这些效果的作用机理尚不十分清楚。从理论上来说,作物吸收和利用矿质元素是通过其体内... 详细信息

中国稀土农用的研究始于20世纪70年代,,通过大量的农业科研与田间试验,证实了适量的稀土有促进农作物增产以及改善品质等效果,但稀土农用是如何产生这些效果的作用机理尚不十分清楚。从理论上来说,作物吸收和利用矿质元素是通过其体内相关的酶催化相应的生化反应来实现的;酶活性影响着作物体内的各种生化反应,从而影响着作物对矿质营养元素的吸收、同化和分配。而稀土元素通过影响酶活性,而影响了相应的矿质元素的吸收、利用与分配。本试验以小麦和油菜为供试作物,通过水培方法并结合室内分析,研究稀土元素镧(La)、钕(Nd)对小麦幼苗体内相关酶活性影响,同时用气相色谱扫描、分离组织提取液中有机物质,同时根据其含量变化发现规律。本试验设镧(La)、钕(Nd)化合物浓度分别为0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、25.0mg/L和50.0mg/L五个处理.植物体内过氧化物酶活性测定采用愈创木酚氧化法,超氧化物歧化酶活性测定用Giannopolitis和Ries的方法。研究结果表明:低浓度的镧(La)、钕(Nd)均在不同程度上促进了小麦幼苗体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的增强;高浓度时总是表现出抑制酶活性的作用。当La、Nd溶液浓度为10mg/L时,小麦地上部分SOD活性达到最大值,对于地下部分La的作用效应与地上部分基本相同,但Nd的作用效果有所差别,当其浓度为5mg/L时,SOD活性达到峰植。当La、Nd溶液浓度为10mg/L时,小麦地上和地下部分POD活性均达到最大值,变化趋势基本相同,只是变幅有些许差别。无论地上部分还是地下部分、POD或者SOD,Nd的变化幅度都要远远大于La,说明Nd对小麦体内酶的调节效应比La强烈。研究表明,稀土元素镧、钕对小麦的根系和地上部位以及油菜地上部分的组织提取液中有机物影响显著,而对油菜根系的有机物影响效果不明显。分离的物质主要有Nonadecane(十九烷)、hexadecanoic acid(棕榈酸)、Octadecane(十八烷)、heptacosane(二十七烷)、tetracosane(二十四烷)、9,12,15-Octacatrienoic acid(9,12,15烯十八酸)等。

关键词：镧钕小麦油菜效应物

响应面法分析效应物对苯丙氨酸解氨酶活性的影响

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食品科技 2006年第10期31卷 58-62页

作者：岳海燕袁其朋刘晓慧北京化工大学生命科学与技术学院北京100029

实验考察了聚乙二醇6000、D-山梨醇、海藻糖、二巯基苏糖醇、甘油、戊二醛对酶反应中苯丙氨酸解氨酶活力的影响。单因子实验发现,0.5%聚乙二醇6000对PAL酶活的影响最大,可提高活力80.3%。响应面实验发现,海藻糖、聚乙二醇6000、二巯基... 详细信息

实验考察了聚乙二醇6000、D-山梨醇、海藻糖、二巯基苏糖醇、甘油、戊二醛对酶反应中苯丙氨酸解氨酶活力的影响。单因子实验发现,0.5%聚乙二醇6000对PAL酶活的影响最大,可提高活力80.3%。响应面实验发现,海藻糖、聚乙二醇6000、二巯基苏糖醇在实验浓度范围内交互作用很小,0.62%海藻糖、0.54%聚乙二醇6000和0.31%巯基苏糖醇的组合可提高酶活92.9%。

关键词：粘红酵母苯丙氨酸解氨酶效应物响应面设计

水稻黄单胞菌效应物转运系统的检测与新的效应物的鉴定

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水稻黄单胞菌效应物转运系统的检测与新的效应物的鉴定

作者：唐唯广西大学

学位级别：硕士

效应物是能通过病原细菌Ⅲ型分泌系统转运至植物或动物细胞内，起到识别或致病作用的蛋白质，效应物对病原细菌的致病至关重要。效应物蛋白从结构上可以分为信号区和功能区，目前已经证明了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas ca... 详细信息

效应物是能通过病原细菌Ⅲ型分泌系统转运至植物或动物细胞内，起到识别或致病作用的蛋白质，效应物对病原细菌的致病至关重要。效应物蛋白从结构上可以分为信号区和功能区，目前已经证明了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris ***)的无毒基因产物AvrBs1第1—58个氨基酸是转运信号，第59—445个氨基酸是负责在辣椒ECW-10R上引起过敏反应的功能区。目前，缺少有效、快速的鉴定水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***)效应物的方法。本研究以野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris ***)的无毒基因产物AvrBs1的过敏反应诱导功能区作为报道，选择在启动子区有PIP-BOX 5个受hrpX调控的基因，Xoo1832，Xoo1842，Xoo2905，Xoo4134和Xoo4365，PCR扩增信号序列后同框连接到报告基因上游，三亲本结合的方法导入Xoo13751和突变体hrcV，过敏反应检测最终确定Xoo4134是一个新的效应物基因，突变体植株试验证明，该基因和致病性有一定关系。本研究同时也证明了该报道系统能在Xoo中工作，因此该系统可以作为Xoo中鉴定新的效应物的良好平台。

关键词：效应物 T3SS AvrBs1 PIP-BOX

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迟缓爱德华氏菌效应物的鉴定及初步功能评价

迟缓爱德华氏菌效应物的鉴定及初步功能评价

作者：黄亚珺华东理工大学

学位级别：硕士

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的水产养殖病原菌,可引发海水鱼类患腹水病、败血症等,造成重大损失。本实验室从先期感染爱德华氏菌的大菱鲆上分离获得强毒株EIB202,并通过转录组学研究及其他筛选策略筛选出25个候选效... 详细信息

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的水产养殖病原菌,可引发海水鱼类患腹水病、败血症等,造成重大损失。本实验室从先期感染爱德华氏菌的大菱鲆上分离获得强毒株EIB202,并通过转录组学研究及其他筛选策略筛选出25个候选效应物。本文着重对其中4个效应物ETAE866、ETAE757、ETAE186和ETAE428进行了分泌和转运特性分析,并考察了它们在细菌黏附、内化及斑马鱼毒力方面的作用。首先,构建了表达效应物β-内酰胺酶融合蛋白的质粒,转入EIB202、ΔT3SS、ΔT6SS菌株中获得一系列重组菌株。利用胞外分泌蛋白免疫印迹分析、荧光能量共振转移(FRET),鉴定出ETAE866和ETAE757依赖于三型分泌系统(T3SS)进行分泌转运,ETAE186依赖于T3SS转运,而ETAE428则依赖于六型分泌系统(T6SS)进行分泌和转运。利用免疫荧光技术和细胞质膜组分蛋白免疫印迹,发现ETAE866和ETAE428转运到细胞内后主要定位于细胞膜组分中,ETAE186定位于细胞质组分中,而ETAE757则可能定位于细胞核中。上述研究综合分析并确定了4个EIB202的效应物的分泌转运特性及胞内定位情况。其次,分别构建了上述效应物的单基因缺失株△0866、△1757、△2186和△2428并利用细胞模型比较了缺失株在细胞黏附、内化和增殖方面与野生株的差异。结果表明,△2428在非吞噬细胞感染模型上具有显著增强的黏附、内化的能力,同时△2428在巨噬细胞感染后期的增殖能力显著增强。随后,在斑马鱼模型上进行攻毒试验,发现△2428具有更好的减毒效果,表明ETAE428在EIB202的毒力机制中扮演着非常重要的角色。最后,对上述4个效应物进行了表达和纯化,并成功获得ETAE428纯化样品,为该效应物的结构和功能研究奠定了基础。上述工作对进一步探究迟缓爱德华氏菌T3SS和T6SS效应物的功能及其与宿主细胞之间的相互作用机制奠定了基础。

关键词：迟缓爱德华氏菌 T3SS T6SS 效应物