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利福平诱导rpoB基因突变活化变青链霉菌66合成放线紫红素

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中国抗生素杂志 2002年第11期27卷 651-652页

作者：张琴胡海峰朱宝泉龚炳永越智幸三上海医药工业研究院上海200040 日本食品综合研究所

变青链霉菌拥有完整的放线紫红素生物合成基因簇 ,但它通常并不合成这一抗生素。引入特定的rpoB基因 ,不仅产生了对利福平的抗性 ,同时活化了放线紫红素的合成 ,表明由该基因编码的RNA聚合酶 β亚基因在抗生素的生物合成调控中起十分重... 详细信息

变青链霉菌拥有完整的放线紫红素生物合成基因簇 ,但它通常并不合成这一抗生素。引入特定的rpoB基因 ,不仅产生了对利福平的抗性 ,同时活化了放线紫红素的合成 ,表明由该基因编码的RNA聚合酶 β亚基因在抗生素的生物合成调控中起十分重要的作用。DNA顺序分析揭示出在rpoB基因上的四种不同突变类型 ,均不同程度地活化变青链霉菌合成放线紫红素 ,表明利福平具有与链霉素类似的功能 ,即活化或加强链霉菌合成抗生素或酶的水平。

关键词：利福平 rpoB基因青链霉菌66 放线紫红素 RNA聚合酶基因突变

天蓝放线紫红素生物合成上调基因的克隆及其对阿维菌素产量的影响

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天蓝放线紫红素生物合成上调基因的克隆及其对阿维菌素产量的影响

作者：余姣姣华中农业大学

学位级别：硕士

放线紫红素和阿维菌素都属于聚酮类抗生素,其中放线紫红素由天蓝色链霉菌通过Ⅱ型聚酮合酶(PKS)途径合成,阿维菌素由阿维链霉菌通过Ⅰ型PKS途径合成。天蓝色链霉菌A3(2)和阿维链霉菌NRRL8165基因组测序已经完成。比较研究不同链霉菌对... 详细信息

放线紫红素和阿维菌素都属于聚酮类抗生素,其中放线紫红素由天蓝色链霉菌通过Ⅱ型聚酮合酶(PKS)途径合成,阿维菌素由阿维链霉菌通过Ⅰ型PKS途径合成。天蓝色链霉菌A3(2)和阿维链霉菌NRRL8165基因组测序已经完成。比较研究不同链霉菌对次级代谢的调控作用有重要理论价值,同时也对相关抗生素工业生产有指导意义。本论文在实验室初筛获得11个对放线紫红素合成有上调作用的天蓝色链霉菌基因组文库粘粒的基础上展开研究,利用属间接合转移系统将11个粘粒分别转到天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌1326中,发现SCOL5E7, SCOL6G2, SCOL5C10, SCOL5C12, SCOL5F10, SCOL5B9在两种菌中皆对放线紫红素合成有上调作用。将这6个粘粒导入阿维链霉菌NRRL8165,经摇瓶发酵和HPLC检测,发现SCOL5B9对阿维菌素多个组份合成均有明显上调作用,其中组分B1a产量提高8倍;其它粘粒没有明显作用。通过粘粒末端测序并亚克隆,将SCOL6G2中对放线紫红素表达有上调作用的基因定位到SCO0431和SCO0432,分别编码一个可能的分泌蛋白和一个可能的胞外肽水解酶;其它粘粒中的功能基因定位尚无定论。阿维链霉菌可作为异源表达抗生素生物合成基因簇的良好宿主,但是需要优化含有大片段DNA质粒的接合转移效率。我们选取MgCl2、NaCl、Ca(NO3)2和CaCl2等4种无机盐,在0-200 mM浓度范围内分别研究其对大质粒向阿维链霉菌接合转移的影响,发现CaCl2有极明显促进作用,MgCl2也有一定提高作用。进一步通过完全随机试验组合CaCl2、MgCl2,筛选出显著提高阿维链霉菌接合转移效率的最佳组合,使大质粒的接合转移效率提高11倍。同时,本研究还发现阿维链霉菌异源表达放线紫红素的最适培养基,成功表达放线紫红素,为进一步研究阿维链霉菌中放线紫红素生物合成的调控奠定基础。

关键词：次级代谢调控因子放线紫红素阿维菌素接合转移异源表达

一种提高天蓝色链霉菌A3(2)放线紫红素产量的新方法——引入赋予链霉素抗性的rpsL突变

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国外医药（抗生素分册） 1999年第2期20卷 72-73页

作者：徐俊

链霉菌是一类丝状土壤细菌,它能产生许多在农业和医学上有重要价值的抗生素.因此,发展链霉菌的推理育种方法以提高抗生素的产量有重要的工业和经济价值.

关键词：链霉素育种天蓝色链霉菌A3 放线紫红素

负调节基因nsdA在链霉菌中同源性及激活沉默抗生素合成基因簇的研究

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生物工程学报 2006年第5期22卷 757-762页

作者：余贞王茜邓子新陶美凤华中农业大学农业微生物国家重点实验室武汉430070 上海交通大学教育部微生物代谢重点实验室上海200030

nsdA基因是在天蓝色链霉菌中发现的抗生素合成负调控基因。以nsdA基因片段为探针，通过Southern杂交发现nsdA存在于多种链霉菌中。根据天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的nsdA序列设计PCR引物，扩增多种链霉菌中nsdA基因并测序。发现在不同链... 详细信息

nsdA基因是在天蓝色链霉菌中发现的抗生素合成负调控基因。以nsdA基因片段为探针，通过Southern杂交发现nsdA存在于多种链霉菌中。根据天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的nsdA序列设计PCR引物，扩增多种链霉菌中nsdA基因并测序。发现在不同链霉菌中nsdA基因的相似性高达77％～100％。其中变铅青链霉菌与天蓝色链霉菌A3（2）的nsdA序列100％一致。变铅青链霉菌通常不合成放线紫红素，中断nsdA获得的突变菌株WQ2能够合成放线紫红素；在WQ2中重新引入野生型nsdA，又失去产抗生素能力。表明nsdA的中断可以激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇的表达；nsdA的广泛存在及其序列高度保守则提示可以尝试用于这些菌种的抗生素高产育种。

关键词：链霉菌负调节基因nsdA 放线紫红素基因中断沉默基因

拟无枝酸菌宿主构建及次级代谢基因簇异源表达

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华中农业大学学报 2022年第3期41卷 164-172页

作者：胡欣瑞贺卫军吕金王业民陶美凤上海交通大学微生物代谢国家重点实验室上海200030

为将生长快、发酵时间短、遗传操作便捷的稀有放线菌拟无枝酸菌TNS106开发成异源表达宿主,通过同源重组将内源的瑞斯托霉素生物合成关键基因rpsA替换为ΦC31和ΦBT1噬菌体细菌附着位点attB,清除代谢背景并引入整合位点,得到菌株HXR1;将... 详细信息

为将生长快、发酵时间短、遗传操作便捷的稀有放线菌拟无枝酸菌TNS106开发成异源表达宿主,通过同源重组将内源的瑞斯托霉素生物合成关键基因rpsA替换为ΦC31和ΦBT1噬菌体细菌附着位点attB,清除代谢背景并引入整合位点,得到菌株HXR1;将含有来自天蓝色链霉菌的放线紫红素基因簇或来自刺糖多孢菌的多杀菌素基因簇的质粒转到HXR1进行异源表达,检测发酵产物。结果显示,HXR1成功表达放线紫红素和多杀菌素;与红色糖多孢菌宿主LJ161相比,放线紫红素的产生提前1 d,产量提高1.3倍。拟无枝酸菌异源表达宿主HXR1可为从链霉菌和稀有放线菌中发现新的次级代谢产物提供有用的平台。

关键词：药物研发稀有放线菌拟无枝酸菌异源表达放线紫红素多杀菌素抗生素次级代谢产物

大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

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华中农业大学学报 2013年第4期32卷 12-18页

作者：郑华亮白亭丽陶美凤华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 上海交通大学微生物代谢国家重点实验室上海200030

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种"沉默"抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个... 详细信息

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种"沉默"抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示:含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。

关键词：变铅青链霉菌大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶放线紫红素十一烷基灵菌红素

大肠杆菌甲基转移酶dcm基因的表达对变铅青链霉菌的多效性影响

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微生物学通报 2014年第9期41卷 1925-1931页

作者：高婕韩铁生丰俊贺新义微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200030

【目的】大肠杆菌的dcm基因编码的DNA甲基转移酶可以特异性地将5′CCWGG3′(W=A/T)序列中第二个胞嘧啶变成5-甲基胞嘧啶。Dcm甲基转移酶发现已有37年了,但其确切的功能不明,本篇主要研究其对变铅青链霉菌的影响。【方法】通过构建克隆... 详细信息

【目的】大肠杆菌的dcm基因编码的DNA甲基转移酶可以特异性地将5′CCWGG3′(W=A/T)序列中第二个胞嘧啶变成5-甲基胞嘧啶。Dcm甲基转移酶发现已有37年了,但其确切的功能不明,本篇主要研究其对变铅青链霉菌的影响。【方法】通过构建克隆、接合转移、异源表达及HPLC、酶切、Southern杂交等方法研究dcm基因的表达对变铅青链霉菌的多效性影响。【结果】首次发现变铅青链霉菌基因组中不含5-甲基胞嘧啶修饰,将dcm基因导入变铅青链霉菌后,接合子菌落比正常菌落小很多,并有放线紫红素产生。【结论】基因组的表观遗传修饰能激活沉默放线紫红素基因簇的表达这一现象,为基因组挖掘隐藏的活性天然产物提供了一条新途径。

关键词： dcm甲基化链霉菌形态分化放线紫红素

诱导对卷曲霉素的抗性活化变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌的抗生素生产(英文)

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中国天然药物 2008年第1期6卷 57-62页

作者：张琴朱宝泉胡海峰上海医药工业研究院上海200040

目的:建立抗生素菌株选育的新方法。方法:变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)的relA突变株的合成微量放线紫红素(Act)和十一烷基灵菌红素(Red),通过诱导对卷曲霉素的抗性,筛选能够恢复或活化Act和Red合成的突变株,并应用蛋白质印迹分析考... 详细信息

目的:建立抗生素菌株选育的新方法。方法:变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)的relA突变株的合成微量放线紫红素(Act)和十一烷基灵菌红素(Red),通过诱导对卷曲霉素的抗性,筛选能够恢复或活化Act和Red合成的突变株,并应用蛋白质印迹分析考察活化或恢复Act或Red的合成与表达两个抗生素生物合成途径中的调节蛋白ActII-ORF4或RedD之间关系。结果:一些卷曲霉素抗性突变株(cap)的突变能够恢复relA突变株被损伤的抗生素合成和活化变铅青链霉菌的抗生素(Act和Red)合成,但没有恢复ppGpp合成,暗示着cap突变能够使天蓝色链霉菌不依赖ppGpp分子启动抗生素的合成;变铅青链霉菌66的cap突变株展现不同的表型,其基因突变的位点或类型可能互不相同。结论:建立了一个新的抗生素生产菌株选育方法,即诱导生产菌株对卷曲霉素的抗性。

关键词：放线紫红素十一烷基灵茼红素卷曲霉素抗性

高通量异源表达技术及其在链霉菌次级代谢调控研究中的应用

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高通量异源表达技术及其在链霉菌次级代谢调控研究中的应用

作者：陈黎华中农业大学

学位级别：硕士

链霉菌中抗生素的生物合成受控于细胞内的调控基因,包括全局性调控基因和途径专一性调控基因。为了从棒状链霉菌NRRL 3585中寻找全局性调控基因,我们构建了棒状链霉菌的cosmid基因组文库。文库中共有2400个克隆（覆盖了基因组7倍）。基... 详细信息

链霉菌中抗生素的生物合成受控于细胞内的调控基因,包括全局性调控基因和途径专一性调控基因。为了从棒状链霉菌NRRL 3585中寻找全局性调控基因,我们构建了棒状链霉菌的cosmid基因组文库。文库中共有2400个克隆（覆盖了基因组7倍）。基因组文库的宿主菌是一株含有接合转移帮助质粒pUZ8002的大肠杆菌。这一独创设计使这个大肠杆菌既可以当做文库的宿主菌,又可以直接作为接合转移的供体菌。用高通量接合转移的方式将基因组文库高效的转移到变铅青链霉菌中去异源表达。利用变铅青链霉菌中含有的两个几乎沉默的抗生素合成基因簇——放线紫红素基因簇和钙依赖抗生素基因簇作为报告系统来筛选文库中的调控基因。文库中有许多cosmid都能使变铅青链霉菌中的放线紫红素和钙依赖抗生素产量提高,这说明这些cosmid中可能含有控制抗生素产量的正调控基因。从这些cosmid中我们找到了一个来自棒状链霉菌的全局性调节因子AfsR。将afsR克隆下来重新接合转移到棒状链霉菌中,使其拷贝数增加。增加了afsR拷贝数的棒状链霉菌克拉维酸的产量提高了5倍,同时一个沉默的全霉素的基因簇也被激活了。

关键词：变铅青链霉菌全局性调控因子大肠杆菌XLUZ β-内酰胺类抗生素二硫吡咯酮类抗生素钙依赖抗生素放线紫红素棒状链霉菌