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鼻咽癌放疗抵抗相关microRNA差异表达谱的建立

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鼻咽癌放疗抵抗相关microRNA差异表达谱的建立

作者：李果中南大学

学位级别：硕士

背景：鼻咽癌系我国南部及东南亚地区常见头颈部恶性肿瘤之一,放射治疗为其首选治疗手段,但放疗抗拒的存在限制了其疗效。肿瘤放疗抗拒的产生是一个多基因、多因子和多机制共同作用的复杂过程,细胞内或者放疗过程中细胞出现对放射... 详细信息

背景：鼻咽癌系我国南部及东南亚地区常见头颈部恶性肿瘤之一,放射治疗为其首选治疗手段,但放疗抗拒的存在限制了其疗效。肿瘤放疗抗拒的产生是一个多基因、多因子和多机制共同作用的复杂过程,细胞内或者放疗过程中细胞出现对放射线抗拒的细胞成分是肿瘤放疗抵抗产生的重要原因。已有的研究显示DNA修复基因蛋白表达量增高、细胞乏氧效应、放疗后促血管生成效应以及自噬性调节是肿瘤细胞对抗放射线的主要途径。但放疗抗拒的具体分子机制目前仍不清楚。 microRNA （miRNA）是一种内源性非编码RNA,通过结合到靶基因mRNA3’非翻译区（3’UTR）抑制其翻译等机制,调控靶基因mRNA的转录进而影响靶蛋白质的表达。miRNA参与到肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等多种恶性生物学行为的调控中。已有研究证实miRNA参与肿瘤放疗敏感性的调控。对放疗抵抗细胞或组织表达改变的miRNA的筛选,将对鼻咽癌放疗抵抗性的逆转、放疗效果的提高提供新的启示和依据。目的：（1）利用X线梯度照射法建立人鼻咽癌放射抗拒细胞（CNE-2-Rs）,为研究放射抗拒机理提供可比性的成对细胞株。（2）Illumina Hiseq2000测序系统检测,与已知数据库进行比对,从两样本RNA中筛选出差异表达miRNA,构建放疗抵抗microRNA表达谱。通过生物信息学分析差异表达miRNA与及其靶基因,研究可能的生物学功能和机制通路,为放疗抵抗相关基因表达及其转录后调节提供更直接的科学线索。方法：（1）建立鼻咽癌放疗抵抗细胞株：应用X射线梯度照射的鼻咽癌CNE-2细胞系筛选出放疗抵抗细胞株CNE-2-Rs;CCK-8法检测放射后细胞生存率差异;应用细胞克隆形成试验检测细胞的放疗敏感性;细胞增殖试验检测细胞放射后增殖能力差异。（2）鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱的建立：将建立的放疗抵抗细胞株与其亲代细胞株提取RNA,通过Illumina Hiseq2000测序系统检测,与已知数据库进行比对,从两样本RNA中筛选出差异表达miRNA。将差异表达的miRNA分为上调组和下调组,分别利用Target-Scan5.1与PicTar2种计算方法对选定的miRNA进行靶基因预测,交集的基因集合分别进行GO富集分析和KEGG分析,预测可能的靶基因和信号通路。结果：（1）X线梯度照射可诱导建立鼻咽癌抵抗细胞：①不同放疗剂量下,CCK-8法检测细胞株CNE-2-Rs的生存率高于CNE-2;②CNE-2-Rs放疗后的增殖能力高于CNE-2,放疗抑制率低于CNE-2;③细胞株CNE-2-Rs集落形成能力强于CNE-2细胞,多靶单击模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线,相关指标均提示CNE-2-Rs较CNE-2具有放疗抵抗性,并具有统计学差异（p＜0.05）。（2）建立鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱。①筛选出具有差异表达已知miRNA192个（上调107个,下调85个,p＜0.05）,其中具有显著差异的miRNA50个（Fold-change＞1.00或Fold-change＜-1.00,p＜0.05;上调36个,下调14个）。②21个miRNA簇（cluster）和miRNA家族（family）都存2个以上miRNA表达的差异。信息分析结果：①GO分析提示：下调的14个miRNA对应的靶基因为富集于“生物高聚物修饰（biopolymer modification）"、“蛋白修饰过程（protein modification process）”等28个生物过程（p＜0.05）。上调的36个miRNA未发现明显富集的生物过程。②KEGG分析提示：下调的14个miRNA对应的靶基因富集于4条通路“肿瘤相关通路（Pathways in cancer）"、“嘌呤代谢途径（Purine metabolism）"、"Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）”和“轴突导向通路（Axon guidance）"信号通路（q＜0.05）;上调的miRNA未有明显的富集通路。结论：（1）本实验通过梯度照射模式证实其可以增加细胞的放疗抵抗性。结果提示,在体外条件下这种筛选模式也可能筛选或诱导出放射抗拒的细胞,为放疗筛选放疗抵抗细胞株提供了一个新的放疗筛选方案。（2）鼻咽癌放疗抵抗相关miRNA差异表达谱的建立,综合信息学分析提供了数个可能的富集生物过程和富集通路,如Wnt通路和相关microRNA,为我们后续的研究提供了研究的方向和依据。

关键词：鼻咽癌放疗抵抗 microRNA KEGG分析

PSME3增强结直肠癌细胞放疗抵抗作用机制的初步研究

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PSME3增强结直肠癌细胞放疗抵抗作用机制的初步研究

作者：宋文南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。课题组前期研究证实MIER3是结直肠癌抑癌基因,并利用蛋白双向电泳筛选获得MIER3相关蛋白PSME3。PSME3是20S蛋白酶体的一种重要激活因子,在多种... 详细信息

研究背景和目的结直肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。课题组前期研究证实MIER3是结直肠癌抑癌基因,并利用蛋白双向电泳筛选获得MIER3相关蛋白PSME3。PSME3是20S蛋白酶体的一种重要激活因子,在多种肿瘤发生发展中扮演着重要角色。然而,PSME3在结直肠癌的功能及其放疗抵抗机制尚不明确。,阐明PSME3在结直肠癌发生发展中的作用及相关机制具有重要临床意义。研究方法1.通过CCK8增殖实验和Transwell侵袭实验检测过表达MIER3对结直肠癌细胞增殖和侵袭能力的影响;2.采用质谱技术分析筛选MIER3相关作用蛋白;3.采用免疫荧光、qRT-PCR、Western blot、免疫组化实验检测PSME3在结直肠癌细胞和组织中的定位及表达情况;4.采用CCK8增殖实验、平板克隆实验、Transwell迁移实验和划痕实验检测干扰PSME3表达对结直肠癌细胞株增殖和迁移能力的影响;5.稳定沉默PSME3对结直肠癌细胞放疗抵抗性的影响（1）分别对SW480/shPSME3和SW620/shPSME3细胞进行6Gy剂量照射,并在照射前0h和照射后24h用细胞周期实验分析G2/M期细胞比例的变化;（2）分别用0,2,4,6,8Gy不同梯度剂量照射SW480/shPSME3和SW620/shPSME3细胞后观察细胞克隆形成的大小;（3）收集6Gy照射前0h和照射后24h的SW480/shPSME3和SW620/shPSME3细胞,通过western blot实验检测G2/M期周期蛋白CyclinB1、p-cdc2的表达。研究结果1.通过CCK8增殖和Transwell侵袭实验发现,与对照组相比,过表达MIER3能够明显减弱结直肠癌细胞DLD1和SW480的增殖（FDLD1=173.686,P＜0.001;FSW480=82.253,P＜0.001）和侵袭（tDLD1=5.54,P=0.005;tSW480=8,766,P＜0.001）能力;2.HMGB1、SNP29、PMSE3 为 MIER3 相关作用蛋白;3.PMSE3在结直肠癌中的表达（1）通过免疫荧光、qRT-PCR、western blot实验发现,PMSE3主要定位在细胞核中,且在SW480、SW620结直肠癌细胞中高表达,而在HCT116、HT29结直肠癌细胞中低表达;（2）免疫组化实验结果显示,PMSE3在结直肠癌组织表达高于癌旁非肿瘤组织（94/163）;4.通过 CCK8 增殖实验（F SW480=325.4,P＜0.0001;FSW620=218.4,P＜0.0001）、平板克隆形成实验（tSW480=14.20,P=0.0001;tSW620=43.47,P＜0.0001）、Transwell 迁移实验（t SW480=9.189,P=0.0008;tSW620=24.15,P＜0.0001）和划痕实验（t SW480=6.741,P=0.0025;tSW620=2.854,P=0.046）发现,PMSE3干扰后SW480/shPSME3和SW620/shPSME3细胞的增殖和侵袭能力明显下降;5.干扰PMSE3表达对结直肠癌细胞放疗抵抗性的影响（1）通过细胞周期实验发现,经照射后的干扰组和对照组G2/M期细胞比例均出现不同程度的升高,且干扰组G2/M期细胞比例升高更明显;（2）平板克隆形成实验显示,在不同梯度剂量照射下,与对照组相比,干扰组细胞克隆形成数目减少;（3）通过western blot实验发现,经照射后的干扰组和对照组细胞中CyclinB1和p-cdc2表达均较前下降,且干扰组CyclinB1和p-cdc2表达下降更加明显;结论下调PSME3表达可能使CyclinB1和p-cdc2蛋白表达下调,致使细胞发生G2/M期阻滞,从而增强结直肠癌细胞的放疗敏感性。本研究的创新之处本课题通过一系列体外实验初步明确PSME3在结直肠癌中的临床价值及放疗抵抗机制。

关键词： MIER3 结直肠癌 PMSE3 细胞周期放疗抵抗

肺癌放疗抵抗相关长链非编码RNA（LncRNA）表达谱初步筛选及功能...

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作者：刘玉凤苏州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:放射治疗（放疗）是肺癌局部治疗的有效手段,但放疗抵抗常见,直接影响临床疗效。有文献报道,long non-coding RNAs（Lnc RNAs）在放疗抵抗中起到重要作用。本研究主要探讨Lnc RNAs在肺癌放疗抵抗中的潜在意义。方法:1、... 详细信息

研究背景和目的:放射治疗（放疗）是肺癌局部治疗的有效手段,但放疗抵抗常见,直接影响临床疗效。有文献报道,long non-coding RNAs（Lnc RNAs）在放疗抵抗中起到重要作用。本研究主要探讨Lnc RNAs在肺癌放疗抵抗中的潜在意义。方法:1、构建放疗抵抗肺癌亚系H460R、A549R。应用梯度增加X射线剂量法对H460、A549细胞反复照射,历时6个月,共照射10次,剂量分别为前3次4Gy,中4次6Gy,后3次8Gy,每次照射间隔为1-2周,累积剂量60Gy。照射完成后抵抗株命名为H460R、A549R。2、利用CCK-8法验证细胞的放疗抵抗性。将H460、H460R与A549、A549R细胞铺96孔板,培养12小时后,分别给予0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy,12Gy,16Gy X线照射,培养48h后,加入CCK8检测。3、放疗对细胞表型的影响。利用流式细胞术检测细胞周期特征。利用Transwell迁移实验验证细胞的迁移能力。4、筛选出与放疗抵抗相关的Lnc RNAs。应用高通量测序,筛选出H460与H460R差异表达的Lnc RNA,再选出其中一个放疗抵抗Lnc RNA MIR4453,做进一步深入研究。5、MIR4453表达下调后对H460R细胞表型的影响。敲低H460R细胞的Lnc RNA MIR4453,检测对H460R细胞放疗敏感性、周期、凋亡及迁移能力的影响。结果:放疗抵抗细胞株H460R、A549R与亲本细胞株H460、A549相比,显示出明显的放射抵抗性。分别给予2Gy,4Gy,6Gy,8Gy,12Gy,16Gy X线照射,抵抗株较亲本均具有更高的存活率。流式细胞术检测发现,细胞周期发生了相应变化,H460R、A549R细胞的G0/G1期比例较H460、A549细胞减少,而S期、G2/M期比例明显增加。Transwell迁移实验显示,放疗增强H460R细胞的迁移能力。高通量测序检测H460与H460R细胞,共有71个差异表达的Lnc RNA（上调36个,下调35个,p＜0.05）。选出其中一个放疗抵抗Lnc RNA MIR4453,下调MIR4453后,能增加H460R细胞的放疗敏感性,降低细胞的迁移能力,并对细胞周期、凋亡有一定影响。结论:1、梯度增加X射线剂量法,能成功构建放疗抵抗肺癌细胞株。2、放疗抵抗肺癌细胞株的生物学特征有显著改变。表现为细胞周期G0/G1期比例减少,S期、G2/M期比例增加,及迁移能力提高。再次给予不同剂量的X线照射,放疗抵抗肺癌细胞株较亲本细胞株生存率高。3、与亲本细胞株H460比较,放疗抵抗肺癌细胞株H460R的Lnc RNAs有显著改变。4、Lnc RNA MIR4453是肺癌细胞放疗抵抗相关Lnc RNA之一。其表达水平的改变,会影响肺癌细胞的放疗敏感性及迁移能力。

关键词：肺癌放疗抵抗高通量测序 LncRNA

MiR-20b-5p靶向下调AEN增强鼻咽癌细胞放疗抵抗的作用与机制研究

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MiR-20b-5p靶向下调AEN增强鼻咽癌细胞放疗抵抗的作用与机制研究

作者：潘青南华大学

学位级别：硕士

目的:分析MiR-20b-5p和AEN(apoptosis enhancing nuclease)表达改变对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞放疗敏感性的影响,并探讨MiR-20b-5p通过靶向下调AEN表达增强鼻咽癌细胞放疗抵抗的分子机制,为鼻咽癌的诊断及治疗提供分... 详细信息

目的:分析MiR-20b-5p和AEN(apoptosis enhancing nuclease)表达改变对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞放疗敏感性的影响,并探讨MiR-20b-5p通过靶向下调AEN表达增强鼻咽癌细胞放疗抵抗的分子机制,为鼻咽癌的诊断及治疗提供分子靶标。方法:采用不同电离辐射(IR)剂量(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)照射,通过CCK-8细胞增殖实验、划痕愈合实验、平板克隆形成实验、Transwell迁移与侵袭实验等方法从不同层面分析MiR-20b-5p和AEN表达改变对鼻咽癌细胞放疗敏感性的影响;采用quantitative real time-PCR(q RT-PCR)、Western Blot等实验探讨MiR-20b-5p通过靶向下调AEN表达增强鼻咽癌细胞放疗抵抗的分子机制。结果:1、MiR-20b-5p表达水平随着放疗剂量(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)的增加而升高,在10Gy时达到最高水平,提示放疗可以诱导MiR-20b-5p的表达。2、相较放射处理前,X线可呈剂量依赖性抑制鼻咽癌细胞的存活;在相同放疗剂量下,上调MiR-20b-5p可明显促进鼻咽癌细胞(CNE1、HNE1细胞)的增殖,而下调MiR-20b-5p表达显著抑制鼻咽癌细胞的增殖。经IR照射后,鼻咽癌细胞的克隆形成能力显著降低,且随着IR照射剂量的增加,鼻咽癌细胞克隆形成能力降低的更为明显;但在相同电离辐射剂量下,上调MiR-20b-5p后鼻咽癌细胞的克隆形成数目显著增加,而下调MiR-20b-5p的表达后鼻咽癌细胞的克隆形成数目明显减少。进一步研究发现,尽管MiR-20b-5p表达改变,鼻咽癌细胞经电离辐射(IR)照射以后,MiR-20b-5p的表达均有增加,但上调MiR-20b-5p可明显削弱放射线对鼻咽癌细胞的杀伤作用,而下调MiR-20b-5p可显著增强放射线对鼻咽癌细胞的杀伤作用。3、在6Gy的IR照射下,上调MiR-20b-5p表达后可显著促进细胞的侵袭、迁移,而下调MiR-20b-5p后明显抑制细胞的侵袭、迁移。结果说明,MiR-20b-5p参与了鼻咽癌细胞放疗抵抗的调控。4、上调MiR-20b-5p可显著降低AEN的表达,而下调MiR-20b-5p可以明显增加AEN的表达;同时还发现,AEN的表达随着放疗剂量的增加逐渐上调(P放疗抵抗。5、过表达AEN可以明显削弱MiR-20b-5p对鼻咽癌细胞增殖的促进作用,敲低AEN则明显逆转下调MiR-20b-5p引起的鼻咽癌细胞增殖抑制作用;与相应对照组相比,无论照射与否,上调MiR-20b-5p表达后,其细胞内AEN及促凋亡蛋白(RARP、caspase-3、Bax)的表达明显减少,而抗凋亡蛋白(Bcl-xl)表达显著增加;而下调MiR-20b-5p表达后,其细胞内AEN及促凋亡蛋白(RARP、caspase-3、Bax)的表达明显增加,抗凋亡蛋白(Bcl-xl)则表达显著减少。结论:1、MiR-20b-5p与鼻咽癌细胞放疗抵抗密切相关,MiR-20b-5p表达上调可增强鼻咽癌细胞的放疗抵抗,其机制与MiR-20b-5p靶向下调AEN的表达有关。2、MiR-20b-5p可能是克服鼻咽癌细胞放疗抵抗的潜在分子靶点。

关键词： MiR-20b-5p AEN 鼻咽癌细胞放疗抵抗细胞凋亡

大分割适形放疗在晚期非小细胞肺癌患者中的应用及放疗抵抗发生与血清miR-123和肝细胞生长因子受体表达的关系

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中国老年学杂志 2019年第24期39卷 5969-5972页

作者：张利伟石安辉娄志霞刘苓苓孙瑞霞中国科学院合肥肿瘤医院肿瘤放疗科安徽合肥230031 北京大学肿瘤医院放疗科

目的探讨大分割适形放疗在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的应用及放疗抵抗发生与血清miR-123和肝细胞生长因子受体(HGFR)表达的关系。方法回顾性总结86例晚期NSCLC患者临床资料(TNM分期Ⅲb~Ⅳ期),均接受单纯的大分割适形放疗,具体方案... 详细信息

目的探讨大分割适形放疗在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的应用及放疗抵抗发生与血清miR-123和肝细胞生长因子受体(HGFR)表达的关系。方法回顾性总结86例晚期NSCLC患者临床资料(TNM分期Ⅲb~Ⅳ期),均接受单纯的大分割适形放疗,具体方案为3.5~6.0 Gy/次,5次/w,总剂量48~60 Gy,共2~3 w,结束后1个月评估临床疗效(显效、有效、稳定和无效),将显效和有效定义为放疗敏感,稳定和无效定义为放疗抵抗,共60例表现敏感,26例表现抵抗。采用反转录PCR(RT-PCR)检测血清miR-123水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HGFR水平。结果所有患者顺利完成放疗,敏感组患者放疗前和放疗后1个月血清miR-123和HGFR水平明显低于抵抗组(P放疗后明显低于放疗前(P抵抗组放疗后与放疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论尽管大分割适形放疗在晚期NSCLC患者中有较好的安全性和有效性,但仍有一定的放疗抵抗发生,可能与机体表达较高水平的miR-123和HGFR密切相关。

关键词：大分割适形放疗非小细胞肺癌 miR-123 肝细胞生长因子受体放疗抵抗

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环氧合酶-2与放疗抵抗相关性的研究进展

现代预防医学 2015年第17期42卷 3261-3264页

作者：王红蒋永新熊伟刘珊葛吕王艳俊昆明医科大学第三附属医院肿瘤研究所昆明医科大学第三附属医院云南省中西医结合肿瘤临床研究中心昆明医科大学第三附属医院放射科

放疗抵抗(radioresistance)是导致临床放疗失败的主要原因,严重影响肿瘤患者治疗效果。环氧合酶-2升高产生的乏氧效应、细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞侵袭转移等多种因素都与放疗抵抗密切相关。研究环氧合酶-2与放疗抵... 详细信息

放疗抵抗(radioresistance)是导致临床放疗失败的主要原因,严重影响肿瘤患者治疗效果。环氧合酶-2升高产生的乏氧效应、细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤细胞侵袭转移等多种因素都与放疗抵抗密切相关。研究环氧合酶-2与放疗抵抗的关系,并寻找有效应对措施以减少或逆转放疗抵抗是提高放疗疗效的关键。因此,对环氧合酶-2的研究可能成为放疗增敏的新思路和新靶点。

关键词：环氧合酶-2 放疗抵抗治疗方法

肿瘤相关成纤维细胞分泌外泌体增强肿瘤细胞放疗抵抗及机制研究

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肿瘤相关成纤维细胞分泌外泌体增强肿瘤细胞放疗抵抗及机制研究

作者：刘磊华中科技大学

学位级别：硕士

目的:结直肠癌(CRC)患者放射治疗中存在放疗抵抗的原因可能是因为肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在,但CSCs引起放疗抵抗的机制目前并不十分清楚。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)可以调节肿瘤细胞的“干性”和肿瘤的放疗敏感性。研... 详细信息

目的:结直肠癌(CRC)患者放射治疗中存在放疗抵抗的原因可能是因为肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在,但CSCs引起放疗抵抗的机制目前并不十分清楚。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)可以调节肿瘤细胞的“干性”和肿瘤的放疗敏感性。研究报道外泌体(Exosomes)可通过细胞-细胞之间的“交流”来调节细胞对治疗的反应。本研究旨在探索CAFs分泌的exosomes是否能够调节结直肠癌的放疗抵抗并探寻进一步机制。方法:我们依据CSCs表面标志CD133从结直肠癌细胞系SW620中分离CSCs。然后我们测定CSCs对放疗敏感性。我们分别将CAFs的条件培养基(CAFs-CM)和其所分泌的exosomes(CAFs-exosomes)作用于SW620细胞,然在细胞和动物水平分别检测SW620细胞的放疗敏感性变化情况。结果:CSCs对放疗表现出天然的抵抗。CAFs-CM促进了SW620细胞的细胞球体的形成。在细胞和动物实验中,CAFs-CM均能增强SW620对放疗的抵抗。进一步实验表明,CAFsexosomes也表现出相似的上述效果,而且去除exosomes的CM不能促进SW620细胞细胞球体的形成,也没有表现出增强SW620细胞放疗抵抗的能力。结论:CAFs促进了结直肠癌细胞的“干性”,并通过这个效应增加了其放疗抵抗。CAFs分泌的exosomes在其中发挥了关键性的作用。

关键词：肿瘤干细胞肿瘤相关成纤维细胞结直肠癌外泌体放疗抵抗

精氨酸甲基转移酶PRMT5调控Mxi1甲基化修饰促进肺癌放疗抵抗的作用机制研究

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精氨酸甲基转移酶PRMT5调控Mxi1甲基化修饰促进肺癌放疗抵抗的作...

作者：阳希洁华中科技大学

学位级别：硕士

目的:癌症是严重威胁人类健康的疾病之一,其中肺癌死亡率居恶性肿瘤的首位。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占原发性肺癌的85%,对于不能或不愿手术治疗的早期和局部晚期NSCLC患者,放疗是其主要治疗手段,但肺癌5年生存... 详细信息

目的:癌症是严重威胁人类健康的疾病之一,其中肺癌死亡率居恶性肿瘤的首位。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)占原发性肺癌的85%,对于不能或不愿手术治疗的早期和局部晚期NSCLC患者,放疗是其主要治疗手段,但肺癌5年生存率仅19%,放疗抵抗是导致肺癌患者局部复发和远处转移的主要原因之一。因此,鉴定肺癌放疗抵抗的分子靶标,进而开发潜在的肺癌放疗增敏剂具有重要的理论意义和临床价值。PRMT5(Protein Arginine Methyltransferase 5)是一种II型蛋白质精氨酸甲基转移酶,参与调控多种细胞生命活动,包括RNA代谢、DNA损伤修复、基因的表观遗传调节等,但是其在肺癌放疗抵抗中的作用与机制尚不清楚。本研究旨在探究PRMT5在肺癌放疗抵抗中的作用和机制及其特异性抑制剂EPZ015666在肺癌中的放射增敏作用。方法:(1)免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)和GST pull down实验验证PRMT5和Mxi1之间的相互作用;(2)运用蛋白质缺失突变的方法明确PRMT5和Mxi1相互作用的结构域;(3)体内外甲基化实验检测Mxi1是否可被PRMT5甲基化;(4)敲低或过表达PRMT5后,进行co-IP实验检测Mxi1与β-Trcp的相互作用;(5)沉默或药物抑制PRMT5后,进行泛素化实验和蛋白质半衰期实验,检测PRMT5对Mxi1蛋白稳定性的影响。(6)构建PRMT5稳定敲低的H1299和A549肺癌细胞系,或给予细胞EPZ015666药物处理,进行细胞功能学实验:中性彗星实验、Rad51焦点形成实验、克隆形成实验。(7)用PRMT5稳定敲低的A549细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,体内检测PRMT5对肺癌放疗敏感性的影响;(8)用A549细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,体内检测PRMT5特异性抑制剂EPZ015666对肺癌放疗敏感性的影响;(9)运用挽救实验同时敲低PRMT5和Mxi1,检测PRMT5的生物学功能是否依赖Mxi1来实现。结果:(1)PRMT5和Mxi1在体内外均存在相互作用;(2)用蛋白质缺失突变的方法构建了四个Mxi1缺失突变体,并进行co-IP实验,证明了Mxi1通过其BHLH-LZ结构域与PRMT5相互作用;(3)体内外甲基化实验证明PRMT5可在体内外对Mxi1进行甲基化修饰;(4)PRMT5可促进Mxi1与E3泛素连接酶β-Trcp结合;(5)泛素化实验和蛋白质半衰期实验发现敲低或抑制PRMT5后,Mxi1蛋白的泛素化减少、半衰期延长、蛋白稳定性增强;(6)中性彗星实验、Rad51焦点形成实验、克隆形成实验均表明沉默或抑制PRMT5后,肺癌细胞的放射敏感性增强;(7)裸鼠移植瘤模型表明,PRMT5沉默可抑制移植瘤的生长并增强移植瘤的放疗敏感性;(8)裸鼠移植瘤模型中,100mg/kg EPZ015666(高浓度)可明显抑制移植瘤的生长,而50mg/kg EPZ015666(低浓度)对移植瘤生长影响不明显;但当给予裸鼠50mg/kg EPZ015666(低浓度)联合放射治疗后,能明显增强移植瘤的放疗敏感性。(9)挽救实验表明同时沉默PRMT5和Mxi1后,可以部分逆转PRMT5沉默在肺癌细胞中的放射增敏的作用,从而证明PRMT5的功能部分依赖于Mxi1。结论:PRMT5与Mxi1的B-HLH-LZ结构域相互作用,使Mxi1发生对称性的精氨酸双甲基化,促进Mxi1与E3泛素连接酶β-Trcp的结合,从而诱导Mxi1泛素化降解,最终导致肺癌的放疗抵抗。因此,我们的研究结果揭示了PRMT5甲基化Mxi1从而调控肺癌的放疗抵抗,提示PRMT5是一个潜在的肺癌放疗增敏靶点,而PRMT5的特异性抑制剂EPZ015666可能成为肺癌放射治疗潜在的增敏剂。

关键词：肺癌放疗抵抗 PRMT5 Mxi1

Oct4对放疗诱导的宫颈癌细胞发生放疗抵抗和EMT作用的研究

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Oct4对放疗诱导的宫颈癌细胞发生放疗抵抗和EMT作用的研究

作者：李扬华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分人宫颈癌耐放疗细胞株的建立及特性检测目的建立稳定的人宫颈癌耐放疗细胞株并检测其有关特性,为开展后续实验做好准备工作。方法(1)选取两种人宫颈癌细胞株Hela和Siha(亲本细胞)进行培养,期间予以X射线反复多次照射处理,照射剂... 详细信息

第一部分人宫颈癌耐放疗细胞株的建立及特性检测目的建立稳定的人宫颈癌耐放疗细胞株并检测其有关特性,为开展后续实验做好准备工作。方法(1)选取两种人宫颈癌细胞株Hela和Siha(亲本细胞)进行培养,期间予以X射线反复多次照射处理,照射剂量2 Gy/次,每周两次,累积剂量达到70 Gy后停止照射。将存活的细胞继续培养并传5代以后分别命名Hela-R和Siha-R。(2)采用以下方法比较Hela-R、Siha-R及各自亲本细胞的有关特性:显微镜下观察放疗前后Hela、Hela-R、Siha和Siha-R的细胞形态;克隆形成实验检测在不同剂量梯度照射下上述各细胞(0、2、4、6和8 Gy)的放射敏感性;分别计数0、4和8 Gy照射后细胞的平板克隆形成数目;流式检测6 Gy和12 Gy照射后48小时细胞的凋亡率;激光共聚焦显微镜观察5 Gy照射后24小时细胞核内γ-H2AX forci的数目;分别采用PCR和Western Blot检测RAD21、TGF-β1与Oct4以及EMT相关分子标志物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等基因的转录水平与蛋白表达水平;Transwell小室及Matrigel基质胶检测放疗前后细胞迁移侵袭能力的变化。结果与各自亲本细胞相比,Hela-R和Siha-R的细胞形态呈去细胞极性和细长梭形样改变。克隆形成实验提示Hela-R和Siha-R对射线的敏感性降低。4 Gy和8 Gy照射后Hela-R和Siha-R的克隆形成数目明显增加。照射6和12 Gy后耐放疗细胞株的细胞凋亡率明显降低。5 Gy照射后24小时Hela-R和Siha-R细胞核内的γ-H2AX forci数目明显减少。PCR和Western Blot检测发现,Hela-R和Siha-R中RAD21、TGF-β1、Oct4、N-caherin以及Vimentin的转录和蛋白表达水平增高,而E-cadherin的转录和蛋白表达水平降低。Transwell小室及Matrigel基质胶实验检测发现,Hela-R和Siha-R的迁移侵袭能力明显增强。结论我们建立的耐放疗细胞株Hela-R和Siha-R的放射敏感性降低,产生了放疗抵抗的特性。耐放疗细胞株中RAD21、TGF-β1和Oct4的表达上调,并且耐放疗细胞株发生了EMT以及迁移侵袭能力增强。第二部分siRNA下调Oct4对耐放疗细胞株放疗抵抗性和EMT的影响目的探讨Oct4与宫颈癌细胞株放疗诱导的放疗抵抗以及EMT之间的关系。方法(1)将Oct4-siRNA转染耐放疗细胞株,Western Blot检验其转染效率。(2)采用以下方法分别检测转染Oct4-siRNA的耐放疗细胞以及转染空载体细胞的相关特性的改变:克隆形成实验检测不同剂量梯度照射(0、2、4、6和8 Gy)后放射敏感性的变化情况;激光共聚焦显微镜观察照射5 Gy后24小时细胞核内残存的γ-H2AX forci数目;流式检测照射6 Gy和12 Gy后48小时细胞的凋亡率;Western Blot检测EMT相关分子标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平;Transwell小室及Matrigel基质胶实验检测迁移和侵袭能力的改变情况。结果与转染空载体对照组相比,转染Oct4-siRNA后耐放疗细胞株发生如下改变:Oct4表达水平显著下降;克隆形成实验结果显示其放射敏感性增强;5 Gy照射后24小时细胞核内残存的γ-H2AX forci数目明显增多;照射6 Gy和12 Gy后48小时转染Oct4-siRNA的耐放疗细胞凋亡率升高;E-cadherin表达水平降低,N-cadherin和Vimentin表达水平升高;Transwell小室及Matrigel基质胶实验显示其迁移和侵袭能力降低。结论Oct4可能是介导放疗过程中宫颈癌细胞株产生放疗抵抗,并发生EMT和迁移侵袭能力增强的重要因素之一;下调Oct4的表达可起到放射增敏和逆转EMT及抑制迁移侵袭的作用。第三部分耐放疗细胞株中RAD21和TGF-β1对Oct4的调控作用研究目的探讨耐放疗细胞株中RAD21和TGF-β1对Oct4的调控机制。方法(1)分别构建针对RAD21、TGF-β1和Oct4的siRNA,将其转染入耐放疗细胞株(Hela-R和Siha-R),Western Blot检测上述三个指标的变化情况。(2)Ch IP实验检测RAD21结合到TGF-β1启动子区的能力。(3)构建RAD21过表达质粒,将其分别转染入Hela和Siha,检测RAD21、TGF-β1和Oct4的表达水平。(4)用TGF-β受体抑制剂LY2109761处理(10 umol/L)耐放射细胞株,然后完成以下检测:不同剂量梯度照射后克隆形成实验检测其放射敏感性的变化;5 Gy照射后24小时共聚焦显微镜观察细胞核内残存的γ-H2AX forci数目

关键词：宫颈癌放疗抵抗 RAD21 TGF-β1 Oct4 EMT siRNA