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支气管败血波氏菌截短BcfA表达的重组蛋白及其免疫活性分析

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江苏农业学报 2021年第3期37卷 699-703页

作者：朱伟峰谭凯王芳程序仇汝龙范志宇陈露江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏南京210014 国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014

为提高支气管败血波氏菌保护性抗原BcfA重组蛋白的表达量和可溶性,对编码BcfA N端373位氨基酸残基之后的BcfA基因碱基序列进行了克隆和表达,截短后的BcfA表达量提高了10倍,且主要为可溶性表达。Western blot结果显示,截短BcfA表达后的... 详细信息

为提高支气管败血波氏菌保护性抗原BcfA重组蛋白的表达量和可溶性,对编码BcfA N端373位氨基酸残基之后的BcfA基因碱基序列进行了克隆和表达,截短后的BcfA表达量提高了10倍,且主要为可溶性表达。Western blot结果显示,截短BcfA表达后的重组蛋白与支气管败血波氏菌感染康复血清反应依然明显。免疫保护力试验结果表明截短BcfA表达的重组蛋白依然对支气管败血波氏菌表现出良好的免疫保护作用。

关键词：支气管败血波氏菌波氏菌黏附因子A(BcfA) 截短表达保护性抗原

鉴别家兔多杀性巴氏杆菌与支气管败血波氏菌的双重TaqMan qPCR方法的建立

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中国兽医科学 2021年第6期51卷 671-677页

作者：程序仇汝龙范志宇胡波陈萌萌宋艳华薛家宾朱伟峰钱莺娟王芳江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095

为提高家兔呼吸道疫病主要细菌性病原检测的可靠性和标准化,根据GenBank中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) Kmt基因与支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica) Fla基因分别设计特异性引物和探针,对反应条件进行优化,建立兔... 详细信息

为提高家兔呼吸道疫病主要细菌性病原检测的可靠性和标准化,根据GenBank中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) Kmt基因与支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica) Fla基因分别设计特异性引物和探针,对反应条件进行优化,建立兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏菌双重TaqMan qPCR方法,并初步用于检测家兔肺脏及鼻拭子临床样本。结果显示,该方法建立的标准曲线在标准品浓度为2.35×106~2.35 copies/μL时有良好的线性关系;与绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌无交叉反应;最低检测限均为2.35 copies/μL;批内、批间重复性检验变异系数均小于2%。检测70份临床样本DNA结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为50.0%,支气管败血波氏菌阳性率为42.9%,混合感染率为21.4%,该方法与细菌分离培养和常规PCR符合率分别为80.0%、 92.0%。以上数据表明,本研究建立的双重TaqMan qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,无需病原菌的培养即可用于临床样品的快速检测,为兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏菌的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、高效、准确的检测方法。

关键词：多杀性巴氏杆菌支气管败血波氏菌双重TaqMan qPCR

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猫源支气管败血波氏菌的分离与鉴定

中国动物检疫 2023年第2期40卷 40-45页

作者：沈莉萍徐锋王晓旭齐新永王建上海市动物疫病预防控制中心上海201103

支气管败血波氏菌是引起猫呼吸道疾病的主要病原之一,而对猫源支气管败血波氏菌的分离鉴定目前国内鲜有报道。本研究对上海市1例有咳嗽症状的德文猫鼻拭子样品进行呼吸系统相关病原PCR检测,并对鼻拭子样品进行细菌分离培养,对分离菌株采... 详细信息

支气管败血波氏菌是引起猫呼吸道疾病的主要病原之一,而对猫源支气管败血波氏菌的分离鉴定目前国内鲜有报道。本研究对上海市1例有咳嗽症状的德文猫鼻拭子样品进行呼吸系统相关病原PCR检测,并对鼻拭子样品进行细菌分离培养,对分离菌株采用K-B纸片法进行药敏试验,同时检测分离菌株对小鼠的致病性。结果显示:猫杯状病毒、猫疱疹病毒、猫衣原体、猫支原体均为阴性,支气管败血波氏菌为阳性,并分离到1株支气管败血波氏菌;分离菌株对头孢拉定、氨苄西林、强力霉素等9种抗生素耐药,对阿莫西林、卡那霉素、氟哌酸、复方新诺明、美罗培南等15种抗生素敏感;用分离菌株接种ICR小鼠,发现小鼠出现精神沉郁症状,但未出现死亡。结果表明:上海市猫群中存在支气管败血波氏菌感染,需关注免疫力低下人群被感染的风险;分离株对小鼠致病力不强,但对首选治疗支气管败血波氏菌病的强力霉素耐药,建议选用敏感药物进行防治。本研究为猫源支气管败血波氏菌病的诊断与防治提供了参考。

关键词：支气管败血波氏菌猫咳嗽分离与鉴定

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兔支气管败血波氏菌保护性抗原初步筛选

兔支气管败血波氏菌保护性抗原初步筛选

作者：谭凯南京农业大学

学位级别：硕士

支气管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）是一种能感染多种哺乳动物、引起鼻炎和肺炎的革兰氏阴性细小杆菌,以犬、猪及兔的感染最为普遍,导致犬传染性支气管炎、猪传染性萎缩性鼻炎和兔支气管败血波氏菌病,也有Bb感染人的病... 详细信息

支气管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）是一种能感染多种哺乳动物、引起鼻炎和肺炎的革兰氏阴性细小杆菌,以犬、猪及兔的感染最为普遍,导致犬传染性支气管炎、猪传染性萎缩性鼻炎和兔支气管败血波氏菌病,也有Bb感染人的病例报道。兔支气管败血波氏菌病是由Bb引起的以鼻炎和肺炎为特征的一种家兔常见的传染病。本病主要通过呼吸道传播,分为鼻炎型、支气管肺炎型和败血型。Bb还可以与其他病原菌协同感染家兔,对群体造成严重影响。鉴于支气管败血波氏菌对兔产业的巨大危害,迫切需要开发一种新的安全、有效的兔支气管败血波氏菌亚单位疫苗来预防和控制兔支气管败血波氏菌的感染。本研究在大肠杆菌中表达了 10个支气管败血波氏菌毒力因子 SodB、IRP1-3、AfuA、Vag8、FimD、Fim3、Fim2、T3SS、SphB1、BcfA,鉴定了表达蛋白的特异性,并对这些蛋白的免疫原性进行了研究,最终筛选到具有良好免疫保护作用的BcfA蛋白,为未来兔支气管败血波氏菌病基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。具体研究如下:1、兔支气管败血波氏菌毒力因子的表达及鉴定本研究参照GenBank公布的支气管败血波氏菌（NCTC8344）全长基因序列,针对十个潜在的支气管败血波氏菌毒力因子SodB、IRP1-3、AfuA、Vag8、FimD、Fim3、Fim2、T3SS、SphB1、BcffA,设计了 10对特异性扩增引物。PCR扩增产物胶回收后,与pET-28a载体进行连接,经特异性引物PCR鉴定,测序正确后,将构建的原核表达载体质粒转化E.coli BL21（DE3）后诱导表达蛋白,经过SDS-PAGE电泳分析,SodB、IRP1-3、BcfA三种蛋白以可溶形式在上清中表达,AfuA、T3SS两种蛋白在上清和包涵体中都有表达,FimD、Fim3、Fim2、Vag8、SphB1主要以包涵体形式表达。Western blot显示,重组蛋白SodB、IRP1-3、AfuA、T3SS、BcfA能被兔Bb特异性阳性血清识别,表明这些蛋白有望成为疫苗候选抗原。2、兔支气管败血波氏菌主要抗原免疫保护作用初步研究以对数生长末期的兔支气管败血波氏菌在小鼠上初步建立了滴鼻攻毒模型,规定了该模型的基本标准;用表达的蛋白免疫小鼠,以建立的攻毒模型标准进行攻毒,同时检测免疫小鼠的抗体水平及其抑菌作用,最终综合评估所筛选的蛋白的免疫原性。首先,挑取支气管败血波氏菌单菌落于5 mLTSB培养基中培养,从第15 h～24 h,每小时取菌液样品用平板计数法进行计数,绘制细菌生长曲线,结果显示,支气管败血波氏菌对数生长末期约在培养20h左右。其次,以1.19×109 CFU～8.94×106CFU（50μL～10μL）不同剂量的Bb通过鼻腔滴鼻进行攻毒,取7d后未死亡小鼠肺脏进行计数,以建立Bb小鼠鼻腔滴鼻攻毒模型,结果显示,以4.17× 107 CFU（体积为35 μL）剂量攻毒的小鼠,在7d内不死亡,并可从小鼠肺部分离出相应的Bb,并以此为攻毒的标准。最后,以能被兔Bb特异性阳性血清识别的并于上清中表达的五个蛋白SodB、IRP1-3、AfuA、T3SS和BcfA免疫小鼠,10只/组,另设10只小鼠为对照组;初次免疫14d后,以同样的剂量再次免疫,10d后,以4.17×107CFU（35μL）剂量、通过鼻腔滴鼻方式进行攻毒,7 d后,取肺脏进行细菌计数:二次免疫后7d,采血清,进行抗体检测。结果显示,五个蛋白组均可以刺激小鼠产生一定水平的特异性抗体;相对于其他蛋白组,从BcfA免疫组小鼠肺脏分离到的细菌最少,保护性相对较好,可作为未来支气管败血波氏菌基因工程亚单位疫苗的候选抗原。

关键词：支气管败血波氏菌原核表达抗原免疫保护 BcfA

家兔呼吸道病原菌多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

同方学位论文库评论

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家兔呼吸道病原菌多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

作者：程序南京农业大学

学位级别：硕士

家兔养殖过程中,呼吸道病在兔病的发病率仅次于兔消化道疾病,随着我国家兔养殖规模化的不断提高,传染性呼吸道病给家兔养殖业带来巨大损失。在众多呼吸道病病原中,多杀性巴氏杆菌是家兔呼吸道病的主要致病菌,感染后引起鼻炎、肺炎以及... 详细信息

家兔养殖过程中,呼吸道病在兔病的发病率仅次于兔消化道疾病,随着我国家兔养殖规模化的不断提高,传染性呼吸道病给家兔养殖业带来巨大损失。在众多呼吸道病病原中,多杀性巴氏杆菌是家兔呼吸道病的主要致病菌,感染后引起鼻炎、肺炎以及败血症等临床症状,常因集约化养殖导致急性暴发引起大量死亡;支气管败血波氏菌常与多杀性巴氏杆菌混合感染,主要引起幼龄兔发病,在兔群大面积传播;铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌同样是引起兔呼吸道病的常见病原菌,病死兔剖检后常见肺脏出血、化脓等症状。四种病原菌在临床症状和病理变化上有一定相似性,且在临床检测中常被一同检出,病兔呈现混合感染。同时值得注意的是,铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌感染人类的报道在国内外也很常见。因此,目前亟待建立一个快速、准确、灵敏度高的家兔常见呼吸道致病菌的鉴别诊断方法。1.四重TaqMan荧光定量PCR方法的建立为建立更快速、有效的家兔呼吸道病致病菌检测方法,本研究利用实时荧光定量PCR技术结合TaqMan探针,参考Gen Bank中多杀性巴氏杆菌kmt基因、支气管败血波氏菌fla基因、铜绿假单胞菌gyr A基因和肺炎克雷伯氏菌pho E基因的保守序列,设计4对特异性引物和4条特异性探针,建立了四重TaqMan荧光定量PCR方法,并对方法的特异性、灵敏度及重复性进行了检验。结果显示,本研究所建立方法的标准曲线在标准品浓度为2.35×10～2.35 copies/μL之间具有良好的线性关系;同其他细菌、病毒基因组之间无交叉反应,仅阳性模板有扩增信号,特异性强;该方法对四种细菌标准品的检测下限均为2.35 copies/μL,最低敏感度比常规PCR高10～100倍;重复性试验变异系数在2%以下,重复性良好。2.四重TaqMan荧光定量PCR方法的初步应用使用该方法对来自山东、江苏、甘肃、黑龙江、福建、川渝地区等地部分兔场的临床病料153份样本进行检测,检出兔多杀性巴氏杆菌阳性86份、支气管败血波氏菌39份、铜绿假单胞菌24份、肺炎克雷伯氏菌67份,混合感染64份。阳性检出份数与普通PCR符合率为90.84%,与测序结果符合率为100%。证明本试验建立的四重TaqMan荧光定量PCR方法特异性良好,敏感度高,且能将样本中感染的四种细菌通过Ct值进行分析,明确主导病原菌,为临床指导用药提供更有力依据,也为家兔呼吸道病的诊断和流行病学调查提供了新的、更准确的方法。

关键词：多杀性巴氏杆菌支气管败血波氏菌铜绿假单胞菌肺炎克雷伯氏菌 TaqMan探针 qPCR