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禽副粘病毒-2膜融合相关多肽基因的构建与表达

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生物化学与生物物理进展 2005年第3期32卷 228-234页

作者：王晓佳朱德兵张国中柏亚铎汪明中国农业大学动物医学院北京100094 航天医学工程研究所北京100094

囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的第一步. 禽副粘病毒-2 (APMV-2) 囊膜表面糖蛋白有2种,与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶(HN) 及介导膜融合的融合糖蛋白(F). HN蛋白的茎部区域(stalk region) 与球状头部区域(globular ... 详细信息

囊膜病毒与宿主细胞的膜融合是病毒入侵宿主细胞的第一步. 禽副粘病毒-2 (APMV-2) 囊膜表面糖蛋白有2种,与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶(HN) 及介导膜融合的融合糖蛋白(F). HN蛋白的茎部区域(stalk region) 与球状头部区域(globular head region) ,以及F蛋白的3段七肽重复区域(heptad repeat,HR) 都可能与膜融合直接相关,将5段多肽进行基因的构建与表达研究. 根据已发表的禽副粘病毒-1 (APMV-1) 氨基酸序列,应用BLAST程序进行同源性分析,以确定APMV-2相应区域,使用搭桥pcr或普通pcr方法构建基因,分别克隆入表达载体pGEX-6p-Ⅰ获得重组质粒,阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3),表达后获得可溶性融合蛋白,3C蛋白酶酶切后的蛋白质混合物经Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化,最终获得可溶性、高纯度的5段多肽. 应用LearnCoil-VMF软件与ExPASy系列软件对蛋白质结构与功能进行预测与分析. 分子筛实验结果表明,F蛋白的HR1与HR2可形成六聚体结构,圆二色谱实验结果则表明,六聚体蛋白富含琢螺旋结构.

关键词：禽副粘病毒-2 球状头部与茎部区域七肽重复区域搭桥pcr

小反刍兽疫病毒N基因部分片段克隆表达及鉴定

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东北农业大学学报 2013年第9期44卷 86-90页

作者：祁光宇刘斌陈晓宇王赛错苟慧天黄银君穆克斌刘学荣中农威特生物科技股份有限公司兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,在此基础上设计2对特异引物分别对N1、N5基因扩增和对N1和N5基因进行搭桥pcr连接,经测序分析后将N1-N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建pET-32a... 详细信息

根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,在此基础上设计2对特异引物分别对N1、N5基因扩增和对N1和N5基因进行搭桥pcr连接,经测序分析后将N1-N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建pET-32a-N1-N5质粒。将pET-32a-N1-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达,将纯化重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明,所表达蛋白以可溶性形式表达并具有能与PPRV阳性标准血清发生特异性反应,为建立快速检测小反当兽疫病毒抗体水平诊断方法奠定基础。

关键词：小反刍兽疫病毒 N1-N5基因搭桥pcr 原核表达可溶性 SDS-PAGE Western-blot

犬瘟热病毒融合蛋白七肽重复区基因的克隆表达

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中国兽医杂志 2005年第9期41卷 6-8页

作者：柏亚铎王晓佳张灿韩春来汪明中国农业大学动物医学院北京海淀100094

根据犬瘟热病毒(C an ine d istem per v irus,CDV)融合蛋白(F)的基因序列,利用L earnCo il-VM F与ExPA Sy软件预测出两个七肽重复区(heptad repeat,HR 1与HR 2),应用搭桥pcr拼接的方法获得HR 1与HR 2基因,将其直接克隆到pGEX-6p-I表达... 详细信息

根据犬瘟热病毒(C an ine d istem per v irus,CDV)融合蛋白(F)的基因序列,利用L earnCo il-VM F与ExPA Sy软件预测出两个七肽重复区(heptad repeat,HR 1与HR 2),应用搭桥pcr拼接的方法获得HR 1与HR 2基因,将其直接克隆到pGEX-6p-I表达载体构建重组质粒,用pcr及双酶切方法鉴定阳性重组质粒,并对其进行测序鉴定。并在大肠杆菌中进行融合表达。

关键词：犬瘟热病毒七肽重复区搭桥pcr 克隆

心脏发育相关基因Foxp4相互作用蛋白的筛选与鉴定

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心脏发育相关基因Foxp4相互作用蛋白的筛选与鉴定

作者：刘华友湖南师范大学

学位级别：硕士

本实验室前期利用酵母双杂交技术,筛选获得了与心脏发育基因Foxp4相互作用的15个候选蛋白,并分析了其中3个候选蛋白与Foxp4相互作用的情况。本文进一步分析其它12个候选蛋白是否与Foxp4相互作用,为研究Foxp4调控心脏发育的信号通路提供... 详细信息

本实验室前期利用酵母双杂交技术,筛选获得了与心脏发育基因Foxp4相互作用的15个候选蛋白,并分析了其中3个候选蛋白与Foxp4相互作用的情况。本文进一步分析其它12个候选蛋白是否与Foxp4相互作用,为研究Foxp4调控心脏发育的信号通路提供信息。本研究首先克隆12个与Foxp4相互作用的候选基因：Acta1、C17orf81、ABHD11、PTP4A3、RMBD5B、TNXB、HLA-DPB1、Loc100288161、COL1A1、COL3A1、COL4A2和FN1。从成人的肌肉和心脏组织中提取总RNA,反转录合成cDNA作为pcr扩增的模板。通过巢式pcr将扩增的目的片段克隆入pMD18T载体,经酶切检测与测序鉴定后,转入真核表达载体pCMV-Myc上。结果表明成功克隆了12个基因并构建出这12个基因的真核表达质粒。我们进一步将12个基因的pCMV-Myc质粒分别与pCMV-Tag2c-Foxp4质粒转染Hek293细胞后,进行免疫共沉淀实验。经抗Flag和Myc单抗两个方向检测Foxp4蛋白与12个蛋白之间的相互作用,证明12个候选对象中有3个候选蛋白Acta1、COL1A1和COL4A2与Foxp4有相互作用。我们同时制备了斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体,检测了Foxp4基因在斑马鱼早期胚胎和成体组织中的表达情况,发现Foxp4从1细胞期开始,随着胚胎发育的延续,其表达量逐渐增多,囊胚期开始下调,90%外包期又开始回升。Foxp4在成体组织中广泛表达,在脑、肌肉和鳃中表达较强,在心脏和眼中表达较弱。我们还进一步研究了其中一个候选基因Fbxl5在胚胎发育过程中的时空表达,并利用基因芯片分析敲低Fbxl5的表达时对其它基因表达的影响。通过搭桥pcr的方法克隆了斑马鱼Fbxl5基因,制备了该基因多克隆抗体。利用该抗体分析了斑马鱼早期胚胎和成体组织中的表达情况,发现Fbxl5在胚胎发育中一直较稳定表达,1细胞期表达较多,随着胚胎发育表达量略有下降,囊胚期开始又回升之后除24 h表达量较低外,其余时期均较稳定表达。斑马鱼成体中,Fbxl5在脑、心脏、肾、鳃、肌肉、肠中表达,其中鳃中表达最强,而在肌肉,肠中表达较弱。利用Fbxl5-MO敲低Fbxl5在斑马鱼胚胎中的表达,分析发育48 h和对照胚胎样品的mRNA含量差异,基因芯片分析结果表明,斑马鱼14295个基因中共检测到差异性表达的基因1874个,包括心脏标志基因tnc、vmhc、myl7等。总之,本文克隆出12个与Foxp4相互作用的候选基因,通过免疫共沉淀技术进一步证明其中3个基因Acta1、COL1A1和COL4A2与Foxp4相互作用,制备了斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体,分析了其在斑马鱼早期胚胎中和成体组织中的表达情况,为进一步探清Foxp4的分子机制奠定了基础。同时,对候选基因Fbxl5开展的一些工作为以后的研究提供了帮助。

关键词： Foxp4 免疫共沉淀搭桥pcr Fbxl5 基因芯片

兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-pcr检测方法研究

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兔出血症病毒（RHDV）与兔出血症病毒2型（RHDV2）的RT-PCR检测方...

作者：赵希仑四川农业大学

学位级别：硕士

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD),俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的兔的一种急性、高度致死性传染病。RHD以呼吸系统出血,实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要病变特征... 详细信息

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD),俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的兔的一种急性、高度致死性传染病。RHD以呼吸系统出血,实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要病变特征,主要危害2月龄以上的养殖和野生的多个穴兔品种,死亡率达80%-100%。RHD于1984年被我国首次报道后,在世界很多国家出现发病和流行的报道,严重威胁着世界养兔业的健康发展,被国际动物卫生组织列为法定通过动物疫病。2010年在法国出现了由RHDV新种即兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus 2, RHDV2)引起的能感染致死30日龄以内的兔r和传统RHDV毒株灭活苗的免疫过的兔子的新型兔病毒性出血症(new rabbit hemorrhagic disease, nRHD),也称为兔病毒性出血症2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHD2)近年来RHD2已扩散至意大利、西班牙、德国、葡萄牙、英国、挪威等多数西欧国家和亚速尔群岛等国。我国目前尚无该病发生及其相关的研究报道,为此本研究在对RHDV2和RHDV基因序列分析基础上对其RT-pcr检测技术进行了初步研究,具体如下：为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法。根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2 VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条搭桥引物,通过搭桥pcr人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立RHDV2 RT-pcr检测方法。结果表明成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段和构建了pMD-19T-RHDV2重组质粒以及pMD-19T-RHDV441,初步建立的RHDV2 RT-pcr方法具有良好的特异性和敏感性,RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测RHDV、pGM-T-EBHSV(已构建)、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌均无特异性扩增。样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。为建立用于兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)鉴别诊断的检测方法,根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,在上面研究的基础上又设计合成1对特异性引物,采用RT-pcr和搭桥pcr技术分别获取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守区片段,构建重组质粒pMD-19T-RHDV2、 pMD-19T-RHDV441(上面已构建)和pMD-19T-RHDV294,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验,以及人工感染RHDV样品和临床样品的应用,对RHDV与RHDV2的复合RT-pcr检测方法进行了初步研究。结果显示建立的RHDV与RHDV2复合RT-pcr方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增山RHDV和RHDV2的VP60保守区基因片段大小为294 bp和435 bp, RHDV与RHDV2的检测限度分别为160和230个拷贝的靶基因片段,而pGM-T-EBHSV(已构建)、兔源巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和兔源沙门氏菌等病原的检测结果均为阴性。样品检测结果显示人工感染样品的RHDV检出率为100%(5/5),30份临床检样RHDV和RHDV2检测结果均为阴性。本研究为我国进行RHDV2的防控提供了一种技术储备和奠定了基础,同时为RHDV和RHDV2的鉴别与流行病学调查提供了科学方法和科学参考。

关键词：兔病毒性出血症 RHDV RHDV2 RT-pcr 搭桥pcr

利用引物探针序列构建转基因马铃薯检测阳性重组质粒及其验证

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安徽农业科学 2019年第23期47卷 213-218页

作者：杨杰李兰戴莉张江国莫善明徐新龙阿拉山口海关技术中心

[目的]通过将特定转基因检测方法引物和探针序列重组拼接,并将重组序列连接至质粒中,验证其作为转基因检测阳性对照的可行性。[方法]通过搭桥pcr和全基因合成的方法制备阳性重组序列,验证阳性重组序列作为阳性对照品的可行性与阳性重组... 详细信息

[目的]通过将特定转基因检测方法引物和探针序列重组拼接,并将重组序列连接至质粒中,验证其作为转基因检测阳性对照的可行性。[方法]通过搭桥pcr和全基因合成的方法制备阳性重组序列,验证阳性重组序列作为阳性对照品的可行性与阳性重组质粒的均一性、稳定性。[结果]通过将引物探针序列顺序拼接构建得到的阳性重组质粒的性状均一,在4和-20℃条件下均能稳定产生阳性结果。[结论]该种阳性重组质粒的构建方法能够满足转基因成分检测方法中阳性对照品的要求。

关键词：引物探针序列转基因检测搭桥pcr 阳性重组质粒

兔出血症病毒与兔粘液瘤病毒二重pcr检测方法的初步研究

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兔出血症病毒与兔粘液瘤病毒二重PCR检测方法的初步研究