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黏菌素促进mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移

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中国农业科学 2022年第14期55卷 2862-2874页

作者：王雪杨蒋君瑶杨璐邵东延吴聪明沈建忠沈应博汪洋中国农业大学动物医学院中国科学院微生物研究所

【背景】黏菌素是人医临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”药物，其同时作为饲料添加剂及治疗用药长期用于畜禽养殖业。2015年，我国研究人员首次报道了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，预示该道防线面临被攻破的风险。... 详细信息

【背景】黏菌素是人医临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”药物，其同时作为饲料添加剂及治疗用药长期用于畜禽养殖业。2015年，我国研究人员首次报道了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，预示该道防线面临被攻破的风险。然而，杀菌浓度及亚抑菌浓度的黏菌素对mcr-1阳性质粒传播的影响仍未知。【目的】以流行最广的mcr-1阳性IncI2型质粒为研究对象，探究不同浓度黏菌素对该质粒接合转移频率的影响，为黏菌素的科学使用提供理论依据。【方法】使用肉汤法进行了不同浓度黏菌素(0.02 4μg·mL-1)作用下携带mcr-1的IncI2型质粒的接合转移试验。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及构建的公式计算不同时间点(1 24 h)的接合转移频率，并分析不同浓度黏菌素对IncI2质粒接合转移频率的影响。使用PI染料、活性氧(ROS)检测试剂盒测定不同浓度黏菌素下供体菌和受体菌的细胞膜透过性和ROS产生量。选取了对照组与低中高浓度3个处理组(0.02、1、4μg·mL-1)进行了转录组测序，使用Deseq2软件进行基因差异表达分析。采用Prism v8.2.0软件对不同组间接合转移频率、细胞膜透过性及ROS产生量的差异进行统计学分析。【结果】结合本研究建立的接合转移频率计算公式表明黏菌素浓度为4μg·mL-1时可在不同时间点提高mcr-1阳性IncI2质粒3–10倍的接合转移频率，而其他浓度则无显著差异。转录组结果显示，与对照组相比，低中高浓度黏菌素均可显著提高IncI2质粒上IV型分泌系统相关基因的表达，其中包括virB1、virB2、virB5以及traC。此外，黏菌素增加了I型菌毛合成基因fim的转录水平。PI染色结果显示当黏菌素浓度为2和4μg·mL-1时，可增强供体菌和受体菌的细胞膜透过性，且转录组结果也显示膜相关基因(ompAX、bamDE、lolB、yiaD、csgEF)的转录水平均出现显著上调。但是黏菌素作用后ROS产生量及相关基因的转录水平无显著提高。【结论】揭示了黏菌素可通过增加细菌IV型分泌系统活性、细胞膜透过性和菌毛的生成从而提高mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移频率。研究结果提示，杀菌浓度无法完全杀死mcr-1阳性大肠杆菌的同时，还能增加质粒传播速度。因此，畜禽养殖业中黏菌素的治疗使用可能维持mcr-1阳性质粒的存在及传播，此外鉴于黏菌素已批准用于人医临床，该现象有可能引起临床黏菌素治疗mcr-1阳性病原菌的失败。

关键词：黏菌素 mcr-1 大肠杆菌 IncI2质粒接合转移

双酚A促进粪肠球菌中信息素调控质粒pCF10介导的耐药基因接合转移

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生态毒理学报 2022年第1期17卷 191-202页

作者：杨雨桐周宏瑞杨晓波王尚薛斌李辰宇赵辰张曦谌志强王景峰邱志刚军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所天津300050

粪肠球菌是一种在自然水体中广泛存在的革兰氏阳性细菌。信息素调控质粒介导的接合转移是造成粪肠球菌耐药基因快速扩散的重要方式。双酚A是一种内分泌干扰物,因其在工业中大量应用造成其在水环境中的广泛分布。本文以信息素调控质粒中... 详细信息

粪肠球菌是一种在自然水体中广泛存在的革兰氏阳性细菌。信息素调控质粒介导的接合转移是造成粪肠球菌耐药基因快速扩散的重要方式。双酚A是一种内分泌干扰物,因其在工业中大量应用造成其在水环境中的广泛分布。本文以信息素调控质粒中比较有代表性的pCF10质粒作为研究对象,研究了双酚A对粪肠球菌中耐药基因接合转移的影响,证实了双酚A可以促进pCF10质粒介导的耐药基因接合转移,且这一结果同双酚A作用浓度和作用时间相关。双酚A影响耐药基因的扩散,是通过促进编码正调控信息素的ccfA基因表达实现的。本文旨在深入理解双酚A影响抗生素抗性基因扩散的环境行为,为耐药基因控制及双酚A环境效应的评估提供理论支持。

关键词：双酚A 粪肠球菌接合转移耐药基因信息素调控质粒

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猪链球菌细菌素基因膜接合转移的研究

中国预防兽医学报 2022年第5期44卷 465-470,507页

作者：王凌利杨亲祝瑶杨文琳曹俊刘思国张万江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研究猪链球菌细菌素基因能否在同种和不同种属之间转移,本研究对供体菌xj-144的红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO进行PCR鉴定,然后以携带猪链球菌细菌素基因的菌株xj-144为供体菌,分别以猪链球菌BAA和粪肠球菌JH2-2株为受体菌... 详细信息

为研究猪链球菌细菌素基因能否在同种和不同种属之间转移,本研究对供体菌xj-144的红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO进行PCR鉴定,然后以携带猪链球菌细菌素基因的菌株xj-144为供体菌,分别以猪链球菌BAA和粪肠球菌JH2-2株为受体菌进行膜接合转移试验,并对接合子进行PCR检测,对经检测正确的接合子进行药敏试验,同时对接合子的细菌素基因簇和供体菌的可移动遗传元件经PCR鉴定,并对整合性接合元件进行基因序列分析。结果显示,供体菌xj-144携带红霉素耐药基因ermB和四环素耐药基因tetO,与受体菌BAA和JH2-2株分别进行滤膜接合转移试验后正确获得了接合子BM-1和JM-1,接合效率分别为8×10;和8×10^(-7)。药敏试验结果显示,供体菌xj-144对红霉素和四环素耐药,受体菌BAA和JH2-2株对红霉素和四环素均敏感,接合子BM-1和JM-1均对红霉素和四环素耐药。且接合子经PCR均扩增出了猪链球菌细菌素的suicin65基因簇;同时,从供体菌和接合子中均经PCR扩增到转座子整合酶int基因;序列分析结果显示,细菌素基因簇与耐药基因ermB、tetO共定位于一个新的整合性接合元件ICESsuxj-144中。上述结果首次证实了猪链球菌细菌素基因可以跨种属水平转移,并且该基因的水平转移与转座子有密切关系,本研究为进一步探究细菌素基因的转移提供了参考依据。

关键词：猪链球菌细菌素接合转移基因水平转移转座子

重金属介导的抗生素抗性基因接合转移研究进展

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环境科学与技术 2023年第10期46卷 61-69页

作者：杨江流乔亚蕊周学章高登军贾芳宁夏大学生命科学学院宁夏银川750021 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室宁夏银川750021 内蒙古自治区动物疫病预防控制中心内蒙古呼和浩特010051 内蒙古医科大学基础医学院内蒙古自治区分子生物学重点实验室内蒙古呼和浩特010051

抗生素抗性基因(ARGs)在人类-动物-环境之间的跨界面传播和聚集已成为公共卫生和环境生态系统的主要问题,ARGs和携带这些基因的可移动遗传元件(MGEs)已被视为新出现的环境污染物。环境重金属介导的ARGs水平转移增加了ARGs在本土微生物... 详细信息

抗生素抗性基因(ARGs)在人类-动物-环境之间的跨界面传播和聚集已成为公共卫生和环境生态系统的主要问题,ARGs和携带这些基因的可移动遗传元件(MGEs)已被视为新出现的环境污染物。环境重金属介导的ARGs水平转移增加了ARGs在本土微生物中富集的潜在风险。目前,研究重金属及其它新污染物诱导的ARGs水平转移已成为环境及其相关学科领域的研究热点。该文综述了重金属作为共选择剂对环境中ARGs接合转移的影响,重点从分子生物学角度分析了重金属引起ARGs接合转移增加的相关机制。重金属介导的ARGs接合转移是ARGs丰度增加的主要原因,重金属引起的接合频率的变化主要与其浓度相关,与毒物兴奋效应一致。相关调控机制包括调节活性氧(ROS)的产生、启动SOS反应、增强细胞膜通透性以及影响接合转移相关基因的表达和ATP合成。阐明在污染环境中(复合)重金属以及重金属与抗生素协同,在不同环境条件下增强ARGs水平转移的机制是今后研究的关键方向,可为重金属介导的ARGs环境行为研究提供一定的参考。

关键词：接合转移抗生素抗性基因重金属活性氧 SOS反应细胞膜通透性

纳米二硫化钼促进粪肠球菌中信息素诱导质粒介导的耐药基因接合转移

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生态毒理学报 2022年第1期17卷 160-169页

作者：周宏瑞杨雨桐杨晓波王尚薛斌李辰宇赵辰张曦谌志强王景峰邱志刚军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所天津300050

粪肠球菌是一种通常寄居在人和动物胃肠道中的机会致病菌,并广泛存在于环境中。其可通过基因的水平转移获得抗生素抗性。纳米二硫化钼(molybdenum disulfide,MoS_(2))是一种新型的二维层状材料,有广泛的应用前景,但缺乏对纳米MoS_(2)完... 详细信息

粪肠球菌是一种通常寄居在人和动物胃肠道中的机会致病菌,并广泛存在于环境中。其可通过基因的水平转移获得抗生素抗性。纳米二硫化钼(molybdenum disulfide,MoS_(2))是一种新型的二维层状材料,有广泛的应用前景,但缺乏对纳米MoS_(2)完整的生物安全评价。本研究以粪肠球菌为接合模型,将纳米MoS_(2)加入接合体系中研究其对信息素诱导质粒pCF10接合转移的影响。研究发现,纳米MoS_(2)具有促进接合转移的作用,其中25 mg·L^(-1)的纳米MoS_(2)促进效果最明显,可以将接合频率提高5倍~8倍。因为纳米MoS_(2)良好的生物相容性对细胞膜通透性、细胞内活性氧水平和接合转移调控基因的表达都没有产生明显影响。纳米MoS_(2)具有吸附性能,而且又是片层状的结构,这使得其可以附着在细菌表面,促进细菌的聚集,进而促进pCF10质粒接合转移的发生。

关键词：纳米二硫化钼粪肠球菌耐药基因接合转移

信号分子AI-2对副溶血性弧菌四环素耐药基因接合转移的影响

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食品安全质量检测学报 2022年第2期13卷 505-510页

作者：王婷林才云姚琳王联珠曲梦李风铃谭志军江艳华王鹏中国海洋大学食品科学与工程学院青岛266003 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室青岛266071 青岛海洋科学与技术试点国家实验室青岛266033

目的探讨信号分子AI-2对海产品中分离的副溶血性弧菌四环素耐药基因接合转移的影响作用。方法分别构建经AI-2处理和未经AI-2处理的副溶血性弧菌和大肠埃希氏菌的接合反应体系,通过菌落计数法测定不同浓度AI-2对副溶血性弧菌四环素耐药... 详细信息

目的探讨信号分子AI-2对海产品中分离的副溶血性弧菌四环素耐药基因接合转移的影响作用。方法分别构建经AI-2处理和未经AI-2处理的副溶血性弧菌和大肠埃希氏菌的接合反应体系,通过菌落计数法测定不同浓度AI-2对副溶血性弧菌四环素耐药基因接合频率的影响,采用逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应法测定不同浓度AI-2对接合转移调控相关基因转录水平的影响。结果副溶血性弧菌Vp2015094和Vp2016058的四环素耐药基因可以通过接合作用转移至大肠埃希氏菌K12中,15、30μmol/L浓度AI-2能显著提高Vp2015094的接合频率(P接合频率(P接合转移调控相关基因tra F的转录水平以及Vp2016058的接合调控相关基因traF、trb B的转录水平(P接合转移,表明AI-2能促进细菌耐药基因的扩散,为建立基于群体感应的细菌耐药性控制技术奠定基础。

关键词：副溶血性弧菌信号分子AI-2 四环素耐药基因接合转移

小檗碱和绿原酸对质粒介导的耐药基因接合转移的影响

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食品安全质量检测学报 2022年第23期13卷 7725-7733页

作者：曹晨阳苏丽李梅韩政纯陈佳赵越凡张强杨保伟西北农林科技大学食品科学与工程学院杨凌712100 石家庄学院化工学院石家庄050035

目的研究小檗碱和绿原酸对质粒介导的耐药基因接合转移的影响及其可能的机制。方法采用微量稀释法测定小檗碱和绿原酸对供试菌株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations,MICs),使用临床实验室标准化委员会(Clinical and Labo... 详细信息

目的研究小檗碱和绿原酸对质粒介导的耐药基因接合转移的影响及其可能的机制。方法采用微量稀释法测定小檗碱和绿原酸对供试菌株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations,MICs),使用临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institution,CLSI)发布的微量肉汤稀释法测定抗生素的MICs,膜接合法测定耐药基因转移水平,S1核酸酶脉冲场凝胶电泳(S1 nuclease pulsed-field gel electrophoresis,S1-PFGE)确定质粒谱,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测接合转移相关基因的表达水平。结果小檗碱对供试的6株多重耐药沙门氏菌和1株大肠杆菌的MICs均为1.25 mg/mL,绿原酸对其的MICs均为6.25 mg/mL,小檗碱的抑菌效果强于绿原酸。小檗碱和绿原酸分别连续诱导供试菌后,16种抗生素对原始株和诱导株的MICs变化程度不同,对庆大霉素和四环素的抗性先增大再减小。小檗碱和绿原酸诱导所得的第2、4、6代子代菌株作为供体,与受体菌大肠杆菌EC600接合时,与原供试菌株相比,绿原酸诱导株的接合频率先增大再减小,小檗碱诱导株的接合频率主要是先减小再略有增大。小檗碱和绿原酸诱导未对原供试菌株携带的质粒产生影响,诱导显著调控了traX和pilL等15个接合转移相关基因的表达水平(P接合频率的变化趋势基本一致。结论小檗碱和绿原酸对质粒介导的耐药基因接合转移有一定的抑制作用,具有作为耐药基因接合转移抑制剂的潜力。

关键词：小檗碱绿原酸质粒耐药基因接合转移

兽医临床常用酸制剂对耐药性质粒接合转移特征的影响研究

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兽医临床常用酸制剂对耐药性质粒接合转移特征的影响研究

作者：薛俊泽吉林农业大学

学位级别：硕士

近年来,随着世界范围内抗菌药物的不合理使用,兽医临床主要致病菌对常用药物已产生了严重的耐药性。抗生素耐药性的出现和流行对人类和动物健康构成了严重威胁,质粒介导的水平基因转移(horizontal gene transfer,HGT)在这一过程中发挥... 详细信息

近年来,随着世界范围内抗菌药物的不合理使用,兽医临床主要致病菌对常用药物已产生了严重的耐药性。抗生素耐药性的出现和流行对人类和动物健康构成了严重威胁,质粒介导的水平基因转移(horizontal gene transfer,HGT)在这一过程中发挥了重要作用。HGT在细菌中的主要途径包括接合、转化和转导,在这三种途径中,接合转移通常被认为是最主要的途径。在抗生素压力下抗菌药物耐药基因传播日趋严重,非抗生素药物与环境中抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)传播之间的关系已受到了高度关注。为此,本研究对兽医临床常用酸制剂在质粒携带的ARGs接合转移中的影响进行研究。研究内容包括以下三部分:首先,分别将含tet(X4)质粒、tet M质粒、tet L质粒及mcr-1质粒的菌株和用电击转化方式制作的两个模式菌构建接合体系,在接合转移实验中加入酸制剂(甲酸,乳酸,磷酸,柠檬酸)进行接合转移试验。结果表明,酸制剂提高了接合转移频率,促进接合转移的发生。在甲酸浓度为0.1%,乳酸浓度为1%,磷酸浓度为1%,柠檬酸浓度为1%时接合频率提高2至7倍,37℃为最适接合温度,当接合时间超过12 h以上时为最佳接合时间。其次,为了进一步探究酸制剂对接合转移的影响,本研究采用供体菌大肠杆菌Z14与受体菌大肠杆菌A10进行表型试验,当加入四种酸制剂(甲酸、乳酸、磷酸和柠檬酸)呼吸水平被显著抑制,Z14与A10供体菌与受体菌的SOD活性被抑制,活性氧水平升高,细胞膜通透性增大。随着酸制剂浓度的增加细胞外膜破坏量逐渐增加,ATP生成量降低,NAD/NADH降低。最后,本研究探究了酸制剂对体内耐药菌群及耐药基因丰度的影响。通过饮水中加入酸制剂饲养小鼠构建体内模型,采用宏基因组方法对肠内容物菌群进行分析。结果表明,加入酸制剂可使肠道菌群丰度增加,抗性基因多样化程度提高。细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢、生物体系统和药物发展等通路的参与度增加。综上,本研究确定了酸制剂对耐药性质粒接合转移的影响,这些发现为ARGs的传播提供了新的见解。

关键词：酸制剂耐药性耐药性质粒接合转移

双酚类物质促进粪肠球菌中信息素调控质粒介导的耐药基因接合转移规律和机制

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双酚类物质促进粪肠球菌中信息素调控质粒介导的耐药基因接合转移...

作者：杨雨桐军事科学院

学位级别：硕士

抗生素自上世纪二十年代面世以来,在治疗细菌感染方面取得了巨大的突破,同时也挽救了无数人的生命。但随着抗生素使用的普及,它所带来的负面影响也逐渐显现,抗生素广泛使用导致的细菌抗生素耐药性对人类公共健康领域产生了严重的影响。... 详细信息

抗生素自上世纪二十年代面世以来,在治疗细菌感染方面取得了巨大的突破,同时也挽救了无数人的生命。但随着抗生素使用的普及,它所带来的负面影响也逐渐显现,抗生素广泛使用导致的细菌抗生素耐药性对人类公共健康领域产生了严重的影响。细菌主要通过两种方式获得抗生素耐药性:第一种方式是由于抗生素的大量使用带来的选择性压力,筛选出了本身具有抗生素耐药性的细菌或经过基因突变对抗生素具有抵抗性的细菌;第二种方式是细菌通过水平基因转移的方式散布携带耐药基因的可移动遗传元件,使更多的细菌获得对抗生素的抵抗作用。可移动遗传元件包括质粒、转座子、插入序列和噬菌体等,其中质粒介导的耐药基因水平转移在耐药基因传播过程中扮演了重要角色。粪肠球菌（Enterococcus faecalis,E.faecalis）是一种在自然水环境中广泛存在的革兰氏阳性细菌。在粪肠球菌中发现了一种由信息素调控质粒（Pheromoneresponsive plasmid,PRP）介导的接合转移,相比于R质粒、F质粒其接合转移的频率和效率都相对较高。其中,pCF10质粒是信息素调控质粒中最有代表性的一种,它介导的接合转移也是导致粪肠球菌中抗生素抗性基因快速扩散的一种有效方式。一直以来细菌耐药领域的研究主要集中在抗生素滥用导致的耐药基因扩散问题上。近些年随着研究的深入,有研究将目光聚焦于如纳米材料、金属离子等非抗生素因素对耐药基因广泛传播的影响,但关于在自然水体中广泛存在的双酚类物质对耐药基因水平转移有何影响目前还没有相关研究。双酚A一度占据着全球工业化学品生产的榜首,其被广泛应用于制造多种工业产品和生活用品。因其与天然雌激素17-β雌二醇化学结构类似,可以干扰人类的内分泌系统,造成多种内分泌相关疾病,多个国家已发布禁止生产和使用双酚A的禁令。随着双酚A逐渐退出工业生产,许多结构与双酚A相似的双酚A类似物逐渐取代其在工业上的地位。这些类似物统称为双酚类物质。近年来的相关研究发现,双酚类物质对人体内分泌系统同样具有干扰作用。原因在于双酚A类似物的化学结构与双酚A十分相似,结构式中均含有两个苯环,不同之处仅在于不同双酚类物质的取代基团不同。因双酚类物质作为环境雌激素类污染物与可以调控质粒接合转移过程的信息素的化学构象相似,我们推测双酚类物质可能影响信息素调控质粒介导的接合转移过程。根据上述分析,本研究提出了双酚类物质可以促进信息素调控质粒pCF10介导的耐药基因接合转移,并且具有信息素效应的假说。本研究建立信息素调控质粒介导的耐药基因接合转移模型,选择了在自然水环境中含量较高和工业中应用相对较多的几种双酚类物质作为研究对象,研究多种双酚类物质对粪肠球菌耐药基因接合转移的影响规律,分析双酚A作用下影响信息素调控质粒接合转移的相关因素,从基因层面、蛋白层面以及形态学等多个方面分析双酚A影响信息素调控质粒接合转移的机制。主要研究结果如下:利用pCF10质粒构建了信息素调控质粒介导的耐药基因在粪肠球菌中的接合转移模型。该耐药基因接合转移模型相对稳定,可用于评估环境雌激素对信息素调控质粒耐药基因接合转移的规律及影响等。在自然水环境中大量分布的或在工业中广泛应用的几种环境雌激素类污染物（如双酚A、双酚S、双酚F、四溴双酚A、四氯双酚A和六氟双酚A等）均显著地促进了pCF10质粒介导的接合转移。双酚A浓度、细菌密度、接合时间、接合温度和供、受体菌比例均可以直接影响耐药基因的接合转移。双酚A影响接合转移不是通过在RP4质粒介导的接合转移体系中被广泛论证的激活细菌氧化抗氧化系统,从而影响细菌细胞膜通透性,最终影响接合转移的途径实现的。双酚A可能是通过促进信息素编码基因ccfA的高表达,使得合成的成熟信息素c CF10含量升高,使接合转移体系处于诱导状态,最终促进了质粒pCF10的接合转移。双酚A促进编码粘附蛋白的prgB基因表达量升高,继而使细菌间粘附作用增强也是双酚A影响耐药基因接合转移的重要机制。同时双酚A与天然激素化学构象较为相似,具有信息素效应。构建了基于耐药基因接合转移的双酚类物质生物学效应评价模型,通过该评价模型定量了本研究涉及的双酚类物质的生物效应,具体生物学效应排序如下:双酚A＞四溴双酚A＞六氟双酚A＞双酚F＞信息素cCF10＞双酚S。在本研究中,我们初步证实了环境浓度下的双酚A能够促进信息素调控质粒pCF10介导的耐药基因接合转移,并对双酚A影响pCF10质粒接合转移的机制进行了初步探讨。除了直接影响人类健康外,双酚A还会增加环境中耐药基因的丰度,使得耐药基因的扩散形势变得更加严峻。本研究将增强社会对环境雌激素污染物生物效应的认识和理解,填补双酚A这一传统环境污染物在生态安全领域的研究空缺。为人类与生态环境和谐共处提供理论基础,或将为实现对双酚A和抗生素抗性基因传播元件的监测和控制这一最终目标提供技术支持。

关键词：双酚类物质粪肠球菌接合转移抗生素抗性基因信息素调控质粒