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双向启动子探针载体的构建及其在谷氨酸棒杆菌中的应用

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农业生物技术学报 2023年第2期30卷 425-435页

作者：曹煜余心宇刘秀霞白仲虎江南大学生物工程学院/工业生物技术教育部重点实验室/粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心

双向启动子(bidirectional promoters,BDPs)为自然界常见表达元件之一，能够为遗传电路设计、代谢途径组装和优化提供新工具，但目前缺乏针对BDPs的高通量筛选手段。为了高通量筛选性能优越的BDPs，用于代谢工程中的多基因调控，本研究... 详细信息

双向启动子(bidirectional promoters,BDPs)为自然界常见表达元件之一，能够为遗传电路设计、代谢途径组装和优化提供新工具，但目前缺乏针对BDPs的高通量筛选手段。为了高通量筛选性能优越的BDPs，用于代谢工程中的多基因调控，本研究构建了一种BDPs活性探针载体p19BDP。该探针基于绿色荧光瞬时表征蛋白传感器蛋白1(green fluorescent sensor for transiently expressed proteins 1,gSTEP1)和瞬时表征蛋白传感器蛋白质标签(sensor for transiently expressed proteins tag,STEPtag)相互作用后会产生荧光的原理，以“头对头”的方式将gSTEP1基因与STEPtag基因连入p19-0质粒(删除tac启动子的pXMJ19质粒改造获得)获得探针载体，在两个基因中间插入BDPs序列后，通过检测荧光信号初步表征BDPs活性。通过转录组数据分析筛选出了8个谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的BDPs，利用探针载体p19BDP对其活性进行表征，其中两个诱导型启动子BDPcat和BDPicl的荧光值较诱导前分别提高了15.9倍和6.2倍，且在一定范围内荧光强度与诱导剂浓度呈正相关；其他6个内源BDPs(BDP1～BDP6)中，BDP6的荧光强度是对照启动子BDPcat(未诱导)的6.8倍。该探针载体不影响菌体生长，且gSTEP1/STEPtag复合物形成后其荧光值保持稳定。以上结果表明，探针载体p19BDP能够灵敏、有效地表征谷氨酸棒杆菌中BDPs强度。本研究为谷氨酸棒杆菌高通量挖掘天然BDPs提供了有效工具，同时为原核生物中BDPs筛选提供了新的思路。

关键词：谷氨酸棒杆菌探针载体双向启动子诱导型启动子

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两个链霉菌复制子探针载体的构建

生物工程学报 1990年第2期6卷 157-161页

作者：邓子新 T.Kieser D.A.Hopwood 华中农业大学土化系农抗研究室英国约翰.英勒斯研究所

因链霉菌质粒的大小、拷贝数各异,并不是所有的质粒都易于分离和纯化,尤其是低考贝的大质粒,质粒的分离提取往往耗资费力。在这种情况下。

关键词：链霉菌复制子探针载体制备

橡胶树白粉病菌HO-73中启动子探针载体的构建

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橡胶树白粉病菌HO-73中启动子探针载体的构建

以绿荧光蛋白基因为报告基因的广宿主启动子探针载体的构建和应用

中国植物病理学会第十一届全国会员代表大会暨2018年学术年会

作者：徐良向刘耀廖小淼何其光刘文波林春花缪卫国海南大学植物保护学院/海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室

橡胶树白粉病菌为专性寄生病原真菌,未发现有性世代,分子遗传体系尚未构建成功,本文以卡那霉素抗性基因作为报告基因,构建适于快速探测橡胶树白粉病菌HO-73启动子的载体,为后续橡胶树白粉菌的分子遗传学研究奠定良好的基础。以PBI121质... 详细信息

橡胶树白粉病菌为专性寄生病原真菌,未发现有性世代,分子遗传体系尚未构建成功,本文以卡那霉素抗性基因作为报告基因,构建适于快速探测橡胶树白粉病菌HO-73启动子的载体,为后续橡胶树白粉菌的分子遗传学研究奠定良好的基础。以PBI121质粒载体为模板,通过PCR扩增卡那霉素抗性基因片段,连入质粒PUC19中,构建四种转录起始位点距报告基因长短不同的启动子活性探针载体PUC19-K1、PUC19-K2、PUC19-K3、PUC19-Kc,将CaMV35S启动子连入到构建的不同卡那抗性基因阅读框架的重组载体中,得到最适的启动子活性探针载体PUC19-K1。于此同时,在前期已完成橡胶树白粉菌全基因组数据的基础上,应用生物信息学软件预测橡胶树白粉菌HO-73基因组数据中具有启动子活性的序列,得到4个理论上具有活性的启动子LY1、LY2、LY3、LY4。根据基因组序列设计引物,通过PCR扩增启动子序列,利用构建的报告系统进行活性测定比较,得到2个调控相对强的启动子。本实验构建的启动子活性检测载体可以有效、灵敏地用于HO-73强启动子的筛选和启动子活性检测。

关键词：橡胶树白粉菌启动子探针载体

来源： cnki会议评论

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微生物学报 1999年第5期39卷 408-415页

作者：马立新史巧娟周俊初陈华癸湖北大学生命科学院农业部农业微生物重点实验室华中农业大学武汉430070

将以绿荧光蛋白基因（ｇｆｐ）的ｃＤＮＡ为模板，用人工合成引物经ＰＣＲ扩增获得的０－９ｋｂＤＮＡ片段克隆到表达载体ｐＥＴ１１Ｃ上构建成ｇｆｐ表达载体ｐＨＮ１１５。从ｐＨＮ１１５上切下的不含启动子，但保留了ＳＤ... 详细信息

将以绿荧光蛋白基因（ｇｆｐ）的ｃＤＮＡ为模板，用人工合成引物经ＰＣＲ扩增获得的０－９ｋｂＤＮＡ片段克隆到表达载体ｐＥＴ１１Ｃ上构建成ｇｆｐ表达载体ｐＨＮ１１５。从ｐＨＮ１１５上切下的不含启动子，但保留了ＳＤ序列的ｇｆｐ基因经克隆载体ＳＫ（＋）和ｐＩＪ２９２５亚克隆后再克隆到广谱稳定性质粒ｐＴＲ１０２上构建成广谱、稳定、可视的启动子探针载体ｐＨＮ１２７。并用它从费氏中华根瘤菌ＨＮ０１的总ＤＮＡ中成功地钓出组成型和诱导型表达的启动子。

关键词：绿荧光蛋白基因中华根瘤菌启动子探针载体

适用于细菌与植物互作研究的gusA启动子探针载体pHN112的构建

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生物工程学报 1999年第2期15卷 259-262页

作者：史巧娟马立新蒋思婧周俊初农业部农业微生物重点实验室华中农业大学湖北大学生命科学院

启动子探针载体是分离和比较启动子效率的合适工具，一般通过报告基因的表达来反映启动子存在的强弱。分离鉴定细菌侵染宿主植物的相关基因的启动子，有助于阐明菌植互作的分子机理。用于互作研究的启动子探针载体至少应具备以下基本条... 详细信息

启动子探针载体是分离和比较启动子效率的合适工具，一般通过报告基因的表达来反映启动子存在的强弱。分离鉴定细菌侵染宿主植物的相关基因的启动子，有助于阐明菌植互作的分子机理。用于互作研究的启动子探针载体至少应具备以下基本条件：一是报告基因的表达不受细菌和宿...

关键词：葡萄糖苷酸酶基因质粒稳定性启动子探针载体

双向启动子的开发及其在大肠杆菌甲羟戊酸生产中的应用

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食品与发酵工业 2024年

作者：段元朔付振浩刘秀霞白仲虎江南大学江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心

双向启动子（bidirectional promoters， BDPs）是指在启动子转录起始位点左右两端7～25 bp内存在一个相反的转录位点的启动子，BDPs可以作为基因元件协调不同基因的表达，并且在单边元件受损的情况下会导致两边基因共同失活，从而实现... 详细信息

双向启动子（bidirectional promoters， BDPs）是指在启动子转录起始位点左右两端7～25 bp内存在一个相反的转录位点的启动子，BDPs可以作为基因元件协调不同基因的表达，并且在单边元件受损的情况下会导致两边基因共同失活，从而实现共调控。然而，如何在原核生物中迅速筛选出高活性BDPs缺乏高效快速的手段。该研究构建了一种在原核生物中迅速筛选出高活性BDPs的方法。根据实验室前期工作，构建了一种BDPs活性探针载体p19BDP，用于完成平板上BDPs快速筛选，最终筛选出2个来自大肠杆菌以及1个来自谷氨酸棒杆菌的-10或-35区单区杂合的高活性BDPs。随后设计了7种对称性文库筛选出8个在谷氨酸棒杆菌中具有双边活性的高活性BDPs，荧光检测发现这8个启动子在大肠杆菌中也具有双向性。最后将筛选出的BDPs应用到大肠杆菌甲羟戊酸（mevalonate，MVA）生产中，与添加0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷的串联表达的T7lac启动子相比，双边分别表达单个基因的BDP-W6在24 h的MVA产量与对照菌产量相似，为19.8 mg/L，48 h的MVA产量为对照菌72.6％的产量，为32.2 mg/L。该研究提供了一种大规模筛选BDPs的研究方案，同时验证了BDPs的有效性，与T7lac启动子的诱导表达相比，BDPs的双向高活性表达更具有经济效益。

关键词：大肠杆菌谷氨酸棒杆菌双向启动子甲羟戊酸探针载体

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枯草芽孢杆菌启动子的克隆及功能验证

福州大学学报（自然科学版） 2013年第3期41卷 391-396页

作者：许丹青李仁宽林娟严芬叶秀云福州大学生物科学与工程学院福建福州350116 酶高效表达国家工程实验室福建福州350002

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定... 详细信息

以pHT01穿梭质粒为骨架,构建以卡那霉素抗性基因为报告基因的启动子探针载体pHT-kan.利用该探针载体在大肠杆菌中克隆枯草芽孢杆菌168的启动子活性片段,挑取得到100个重组子.通过卡那霉素浓度梯度筛选出2个抗性最强的片段进行序列测定和分析,将启动子片段命名为BSP25、BSP31.将抗性最高的两个载体转入枯草芽孢杆菌168菌株,结果表明,它们可以在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达,重组菌株表现出卡那霉素抗性.

关键词：枯草芽孢杆菌探针载体启动子克隆卡那霉素