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核酸适体及其在疫病诊断中的应用

动物医学进展 2011年第7期32卷 80-84页

作者：祖立闯王金良李娇沈志强山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600

核酸适体是采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。因其具有亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等优点,逐渐成为抗体的代替或补充试剂,已成功应用于生物... 详细信息

核酸适体是采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。因其具有亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等优点,逐渐成为抗体的代替或补充试剂,已成功应用于生物芯片、生物传感器、分子信标等多种疫病诊断技术平台,显示出了良好的应用前景,在未来的疫病诊断中将发挥越来越重要的作用。论文就适体技术及其在疫病诊断中的应用进展进行综述。

关键词：核酸适体指数富集配体的系统进化技术疫病诊断

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链球菌适配体制备及应用

链球菌适配体制备及应用

作者：王鑫江南大学

学位级别：硕士

指数富集配体的系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX），是90年代初研制成功的一种新的组合化学技术。适配子（Aptamer）实质是利用SELEX技术，从体外人工合成的随机寡核苷酸（ssDNA）文库... 详细信息

指数富集配体的系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX），是90年代初研制成功的一种新的组合化学技术。适配子（Aptamer）实质是利用SELEX技术，从体外人工合成的随机寡核苷酸（ssDNA）文库中经过数轮反复筛选，得到的与靶分子具有极高特异性和亲和力的一段寡核苷酸序列。目前，已报道的食源性致病菌的检测方法多种多样，但各有其优缺点。本研究通过细胞SELEX技术（Cell-SELEX）筛选，得到了两种致病菌（化脓链球菌和无乳链球菌）的寡核苷酸适配子，并且建立了基于寡核苷酸适配子识别的新型检测技术。本文首先体外合成一个80nt，中间40个随机碱基序列的ssDNA文库，以化脓链球菌为靶标，通过Cell-SELEX技术及反筛SELEX技术（counter SELEX）进行12轮重复筛选，将筛选得到的DNA序列进行克隆、测序。运用DNAMAN软件、RNAstructure软件对其进行一级结构及二级结构分析;通过羧基荧光素（FAM）标记筛选得到的ssDNA适配子，运用流式细胞术考察了适配子与目标化脓链球菌适配子结合的亲和力和特异性，筛选得到两条亲和力高、特异性强的适配子，其解离常数分别为44.25±5.203nmol/L、53.89±7.586nmol/L，与化脓链球菌的结合率为77.05%、72.65%。同时，体外合成另一个相同长度、不同引物的寡核苷酸文库，以无乳链球菌为靶标，采用与化脓链球菌类似的方法得到了可以与无乳链球菌特异结合的7条寡核苷酸适配子，对其进行FAM荧光标记，通过流式细胞术从中筛选得到两条高亲和力、高特异性适配子，与无乳链球菌的结合率分别为77.33%、80.95%，解离常数为78.27±12.85nmol/L，49.88±6.871nmol/L。随后，本研究以磁珠-适配子复合物为捕获探针，以FAM荧光素标记的适配子为显示探针，成功构建了灵敏、快捷的食源性致病菌荧光检测新方法。在实验优化条件下，化脓链球菌菌落个数在70-7100cfu/mL范围内时，与荧光强度呈良好线性关系，检出限为70cfu/mL，牛奶样品中的加标回收率为83.9%-103.3%;无乳链球菌菌落个数在50-5200cfu/mL范围内时，与荧光强度呈良好线性关系，检出限为50cfu/mL，牛奶样品中的加标回收率为95.2%-102.5%。

关键词：指数富集配体的系统进化技术寡核苷酸适配子化脓链球菌无乳链球菌磁性纳米材料

黄曲霉毒素B1核酸适体筛选和检测方法的建立

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黄曲霉毒素B1核酸适体筛选和检测方法的建立

作者：张敏河北农业大学

学位级别：硕士

黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)是以二呋喃环和氧杂萘邻酮为基本结构的一类化合物,是一种毒性极强的真菌毒素,被世界卫生组织癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物,可引起肝癌等多种疾病,极易污染花生、玉米、小麦等农产品及其食品,快速灵敏的AF... 详细信息

黄曲霉毒素B(Aflatoxin B,AFB)是以二呋喃环和氧杂萘邻酮为基本结构的一类化合物,是一种毒性极强的真菌毒素,被世界卫生组织癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物,可引起肝癌等多种疾病,极易污染花生、玉米、小麦等农产品及其食品,快速灵敏的AFB检测方法的研发及应用是防止其食品安全事件发生的基础。核酸适配体是一段能与靶标分子高亲和力、特异性结合的单链寡核苷酸序列,具有稳定的二级结构和特殊的三维构象,被誉为“化学抗体”,可通过指数富集配体的系统进化技术从体外筛选获得。本试验利用非固定氧化石墨烯法筛选AFB适配体,并以所获得的AFB适配体为特异性识别探针,纳米金为指示剂,建立了一种AFB的比色检测方法,为食品安全提供技术支持。AFB特异性适配体的氧化石墨烯-SELEX筛选。基于氧化石墨烯可通过π-π共轭吸附单链寡核苷酸ssDNA,而对已结合靶标的ssDNA吸附能力较弱的特性,设计了针对AFB核酸适配体的筛选方案。首先构建一个全长为80bp,两端为固定序列、中间含40bp随机序列的ssDNA随机文库。将预处理的随机文库与AFB孵育,然后加入氧化石墨烯溶液吸附未结合靶标的ssDNA,已结合靶标的形成AFB-ssDNA复合物,离心后保留在上清液中,经乙醇沉淀回收所得ssDNA做为模板,经PCR扩增后回收产物并纯化,获得每一轮筛选出的备选适配体。通过10轮筛选,其中第六轮和第八轮增加了其他真菌毒素的筛选。将第八轮和终轮筛选产物克隆测序共获得45条ssDNA序列,挑选具有代表性6条序列进行亲和力分析试验,其解离常数(Kd)分别为16.29、27.88、18.54、23.11、47.94、22.31nmol/L。选用亲和力较高的AFB-5、AFB-8进行特异性分析试验,结果显示所筛选的适配体能特异性吸附AFB,特异性良好。基于核酸适配体和纳米金变色效应建立了AFB的可视化检测方法。单分散的纳米金粒子在溶液中呈酒红色,纳米金粒子与适配体在静电作用下相互结合,能使纳米金抵抗盐诱导,避免团聚变色。当溶液中加入AFB时,适配体与AFB特异性结合,在竞争作用下将原本与纳米金结合的适配体争夺下来,使纳米金与适配体分离,在NaCl作用下出现团聚。通过优化试验条件,得到最佳盐浓度和适配体浓度,该方法检出限为0.025ng/mL,线性范围为0.0250ng/mL,且在520nm下AFB浓度与OD值有良好的线性关系,其回归方程为y=-0.00709x+0.46142(R2=0.9979)。通过特异性试验和对大米样品加标回收,加标回收率为83%05%,证明本方法的可行性。

关键词：黄曲霉毒素B1 核酸适配体指数富集配体的系统进化技术纳米金比色

病原细菌DNAzyme的筛选及基于CRISPR-Cas12a的DNAzyme传感器的构建

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病原细菌DNAzyme的筛选及基于CRISPR-Cas12a的DNAzyme传感器的构建

作者：袁思琪华中师范大学

学位级别：硕士

我国作为农业大国,粮食生产的稳定发展,对保障国家粮食安全意义重大。植物细菌性病害是我国农业生产中的常发性病害,由于传播方式多样,且防治药剂缺乏,导致防治难度日益加大,严重威胁了粮食作物安全。而水稻作为我国的主要粮食作物,其... 详细信息

我国作为农业大国,粮食生产的稳定发展,对保障国家粮食安全意义重大。植物细菌性病害是我国农业生产中的常发性病害,由于传播方式多样,且防治药剂缺乏,导致防治难度日益加大,严重威胁了粮食作物安全。而水稻作为我国的主要粮食作物,其细菌性病害水稻白叶枯病在我国各大稻区均有发生,造成了严重的水稻减产和经济损失。因此发展一种灵敏、准确以及便捷的病原检测方法,实现细菌病害的早期诊断,对降低农药用量,提升防治效果具有重要意义。脱氧核酶(DNAzyme)作为能对靶标进行特异性识别,并且具有特定催化活性的一类功能核酸,具有合成方便、易于修饰的特点,被广泛用于各类生物传感器的设计中。指数富集配体的系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是获取给定靶标特异性DNAzyme的主要途径。同时,基因编辑技术CRISPR-Cas12a系统具有对单链DNA分子的反式切割活性,通过结合传感器进行设计,可以实现常温下的信号放大。在本研究中,首先尝试利用SELEX技术筛选特异性识别水稻白叶枯病菌的DNAzyme。同时,利用靶标识别元件DNAzyme以及CRISPR-Cas12a系统设计了一类能够实现常温信号放大的核酸生物传感器。本论文从以下两方面进行研究:1.细菌生长会分泌多种物质,为避免繁琐的分离纯化,我们首先直接提取白叶枯病菌的胞外分泌物(Crude extracellular mixture,CEM),作为筛选靶标。通过设计筛选 ssDNA 文库,加入 RNA 裂解荧光脱氧核酶(RNA-cleaving fluorescent DNAzyme,RFD)的设计,基于SELEX技术进行筛选。我们一共进行了十四轮正筛,反筛(培养基、buffer以及其他菌的CEM)。在筛选过程中,通过逐轮减少筛选文库的量以及缩短反应时间来增加筛选效率。最终我们通过监测筛选过程以及高通量测序发现筛选文库出现了富集。通过对富集最高的前三条DNA序列的特异性切割能力进行测试,发现并未得到针对靶标白叶枯病菌的特异性DNAzyme,其他富集序列有一定同源性,具有更进一步分析价值。2.大肠杆菌是一种革兰氏阴性杆菌病原微生物,在环境中广泛存在。我们以该菌为模型,根据文献报道的DNAzyme序列,结合磁珠分离技术以及CRISPR-Cas12a系统设计了一类新型核酸生物传感器。利用DNAzyme对于靶标大肠杆菌的识别产生激活剂链,激活Cas12a系统对信号分子的剪切,从而产生荧光信号。经过体系的优化,当靶标与磁性DNAzyme复合物孵育时间为2 h时,检测灵敏度可以达到102 CFU/mL。并且该传感器能够实现对靶标的特异性检测,以及在复杂样品中仍具有一定的检测能力。通过将传感器与蔗糖酶结合进行设计,将加入的蔗糖转化为葡萄糖,利用血糖仪初步实现了对致病菌的户外即时检测。目前,该设计有待进一步优化。综上所述,我们首先提取白叶枯病菌的胞外分泌物CEM,利用SELEX技术对白叶枯病菌的DNAzyme进行了初步筛选。此外,我们还设计了一类DNAzyme调控CRISPR-Cas12a传感器,该传感器能够实现常温下信号放大以及具有户外检测的能力。本文对于后期优化筛选条件得到白叶枯病菌的DNAzyme,结合该类传感器进行设计实现等温信号放大,从而实现田间对水稻白叶枯病的早期诊断具有一定的参考价值。

关键词：脱氧核酶白叶枯病菌早期诊断指数富集配体的系统进化技术核酸传感器

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基于适配体识别的棒曲霉素检测方法研究

基于适配体识别的棒曲霉素检测方法研究

作者：张维潇江南大学

学位级别：硕士

棒曲霉素是由青霉属、曲霉属、丝衣霉属产生的真菌代谢毒素,对人体有一系列急性毒性和致畸致癌等慢性毒性。已报道的棒曲霉素检测方法有高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等,但在不同程度上存在灵敏度、检测限、成本、操作难易度、是否能... 详细信息

棒曲霉素是由青霉属、曲霉属、丝衣霉属产生的真菌代谢毒素,对人体有一系列急性毒性和致畸致癌等慢性毒性。已报道的棒曲霉素检测方法有高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等,但在不同程度上存在灵敏度、检测限、成本、操作难易度、是否能现场检测等缺陷。适配体是是一类能以高亲和力与各类靶分子特异结合的单链寡核苷酸,可通过指数级富集的配体进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)从体外筛选而得,具有高亲和性、高特异性、操作方便、保藏稳定等显著特性。本研究通过基于氧化石墨烯的SELEX筛选方法,获得棒曲霉素的寡核苷酸适配体,构建了基于适配体识别的棒曲霉素可视化检测方法。首先,基于氧化石墨烯可通过π-π共轭吸附单链寡核苷酸ss DNA而不吸附与靶标相结合ss DNA的特性,构建了免固定化的适配体筛选方法。对真菌毒素棒曲霉素适配体共进行15轮SELEX筛选,将十二轮与十五轮产物进行克隆、测序,得到60条序列进行一级结构与二级结构分析。挑选出8条序列进行亲和性、特异性分析,最终得到高亲和性、高特异性的PAT-11,其解离常数为21.83±5.022 nmol/L。其次,以筛选得到的适配体为分子识别元件,利用纳米金的变色效应,构建了一种基于适配体识别棒曲霉素的可视化检测方法。在优化的检测条件下,棒曲霉素浓度与A650/A521比值具有良好的线性关系,其回归方程为y=0.22026x+0.13648(R2=0.9909),线性范围为0.1 ng/m L到10 ng/m L,最低检测限为0.086 ng/m L。通过特异性实验和对苹果汁样品加标回收,加标回收率为95.0006.20%,证明本方法可用于实际样品的检测。最后,基于葡萄糖氧化酶的催化作用、方酸与铁离子的络合作用,构建了一种基于适配体识别的棒曲霉素可视化检测方法。将纳米金上修饰适配体与葡萄糖氧化酶作为捕获探针,氨基化磁珠连接的生物化适配体短链复合物作为分离探针,过氧化氢在葡萄糖氧化酶催化葡萄糖时产生,此后其再氧化二价铁离子为三价铁离子,三价铁离子能与方酸特异络合为红色物质,可通过紫外吸收光谱进行表征。在优化的检测条件下,棒曲霉素浓度在0.05 ng/m L到25 ng/m L范围内与469 nm处紫外可见吸光度值呈现良好的线性关系,线性回归方程为y=0.15606x+0.05182(R2=0.9905),最低检测限为0.048 ng/m L。通过特异性实验和对苹果汁样品的加标回收,加标回收率为91.2008.88%,证明本方法可用于实际样品的检测。

关键词：适配体指数富集配体的系统进化技术棒曲霉素可视化检测

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赭曲霉毒素A核酸适配体的筛选、鉴定及应用

赭曲霉毒素A核酸适配体的筛选、鉴定及应用

作者：李敏天津科技大学

学位级别：硕士

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由各种曲霉属和青霉属等真菌产生的次生代谢产物,广泛存在于谷物和食品中,对人类和动物都有很大的危害。核酸适配体是通过指数富集的配体进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enri... 详细信息

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由各种曲霉属和青霉属等真菌产生的次生代谢产物,广泛存在于谷物和食品中,对人类和动物都有很大的危害。核酸适配体是通过指数富集的配体进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)经体外筛选得到的单链寡核苷酸(ssDNA或RNA),它们可通过自身形成特定复杂的空间三维结构以高亲和力和特异性结合靶标分子。本研究通过改良的氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)的SELEX筛选方法,获得OTA的核苷酸适配体,结合GO淬灭荧光和胶体金分光光度法技术,构建了两种基于适配体识别OTA的快速灵敏的检测方法。首先,基于GO吸附单链寡核苷酸ssDNA的原理,采用免固定化的GO-SELEX方法筛选OTA毒素适配体。经过10轮筛选获得适配体富集文库,经克隆测序后得到23条适配体候选序列,经一级、二级结构,亲和性和特异性分析,得到一条特异识别OTA毒素的最佳适配体Seq.14,其解离常数为138.9±4.9 nmol/L。其次,基于羧基荧光素(FAM)标记的适配体与GO之间的荧光共振能量转移(FRET)技术,构建了一种荧光传感器。当无OTA存在时,FAM标记的适配体被GO吸附并淬灭其荧光信号;当有OTA存在时,适配体与OTA结合,从GO上脱落,引起荧光的重新恢复。在最优条件下,OTA毒素浓度在20～3000nmol/L之间与荧光强度呈线性相关性(R2=0.995),检测限为21.8nmol/L,加标回收率范围在96.0～119.7%之间,相对标准偏差为3.8%。该方法可用于红酒样品中OTA毒素的检测。最后,基于核酸适配体对靶标的特异性和胶体金分光光度法的灵敏性,建立了一种简单快速检测OTA的方法。利用核酸适配体能够抑制胶体金在高盐溶液中的聚集,当OTA存在时,其与适配体特异性结合,使胶体金发生聚集,胶体金的颜色发生变化。在最优的条件下,吸光度的比值(A656nm/A520nm)与OTA浓度在0～300 ng/mL的范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为y=0.001x+0.2264,线性相关系数R2为0.9962,加标回收率为99.2～103.1%,相对标准偏差为4.4%。该方法稳定性和重复性较好,可作为OTA的快速检测方法。

关键词：赭曲霉毒素A 核酸适配体指数富集配体的系统进化技术氧化石墨烯胶体金分光光度法

利用SELEX技术筛选高危型HPVL1蛋白适体的研究与探讨

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利用SELEX技术筛选高危型HPVL1蛋白适体的研究与探讨

作者：肖昕华中科技大学

学位级别：硕士

目的：人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的必要前提。筛查HPV感染是宫颈癌早发现、早预防、早治疗的关键。利用指数富集配体的系统进化(SELEX)技术，筛选出与高危型HPV(HR-HPV) L1蛋白高亲和力、高特异性结合的适体，配合特异性IgY建... 详细信息

目的：人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的必要前提。筛查HPV感染是宫颈癌早发现、早预防、早治疗的关键。利用指数富集配体的系统进化(SELEX)技术，筛选出与高危型HPV(HR-HPV) L1蛋白高亲和力、高特异性结合的适体，配合特异性IgY建立酶连接适体混合吸附体系(ELASA)，用于快速检测HR-HPV。方法：运用生物信息学分析方法对我国常见HR-HPV(16、18、58、52和31型)L1蛋白的B细胞抗原表位进行综合分析，建立HR-HPV抗原表位肽谱;人工合成抗原表位肽，以此为靶标，利用SELEX技术，从体外合成的全长78nt(其中包含35nt的随机序列)的寡核苷酸文库中筛选出能特异性识别HR-HPVL1蛋白的DNA核酸适体，结合动物免疫获得的特异性IgY建立针对HR-HPV的ELASA体系;用经临床HC-2检测确诊的HR-HPV感染的宫颈分泌物检验该体系检出HR-HPV的特异性和灵敏度。结果：人工合成的2个具有诊断潜能的B细胞抗原表位肽，其纯度大于99%。经过多轮的SELEX筛选，得到18条适体链序列，序列的相似性为69.14%，适体的二级结构以发卡、茎环为主。其中与多肽的结合能力最高的是3、7和12号适体，12号适体的Kd值可低至53.93nmol/L。经动物免疫获得的IgY效价为1:12500:62500。适体结合IgY建立的ELASA体系有良好的特异性和灵敏度。结论：本研究利用SELEX技术成功筛选到针对我国常见HR-HPV L1高亲和力、高特异性的ssDNA适体群，结合特异性IgY建立用于快速检测HR-HPV的ELASA体系。

关键词：指数富集配体的系统进化技术 HPV L1 适体酶连接适体混合吸附法

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核酸适体及其在疫病诊断上的应用

中国动物传染病学报 2010年第6期18卷 60-66页

作者：祖立闯王金良李娇王晓虎沈志强山东绿都生物科技有限公司滨州256600 山东省滨州畜牧兽医研究院滨州256600

核酸适体是指采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。鉴于适体特有的亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等特点,其被广泛应用于分析化学、基因调控、蛋... 详细信息

核酸适体是指采用指数富集配体的系统进化技术从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶物质高特异性、高亲和力结合的配体。鉴于适体特有的亲和力高、特异性强、精确识别、易体外合成与修饰等特点,其被广泛应用于分析化学、基因调控、蛋白质组学和新药研发等领域。在疫病的检测方面,核酸适体逐渐成为抗体的代替或补充试剂,已初步应用于生物芯片、生物传感器、分子信标等多种检测技术平台,并具有良好的敏感性和特异性,显示出了良好的应用前景。本文就适体技术及其在疫病诊断中的应用进展作一综述。

关键词：核酸适体指数富集配体的系统进化技术疫病诊断

SELEX技术及核酸适配子在临床诊断中的应用前景

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国外医学（内科学分册） 2006年第11期33卷 489-492页

作者：邬芳玉张贝张焜和南昌大学第一附属医院消化内科江西南昌330006

指数富集配体的系统进化技术是一种新的组合化学技术,它利用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外多轮筛选与扩增,获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适配子。适配子的靶分子广泛,与靶物质结合的亲和力高、特异性强,在制备及稳定性等... 详细信息

指数富集配体的系统进化技术是一种新的组合化学技术,它利用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外多轮筛选与扩增,获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适配子。适配子的靶分子广泛,与靶物质结合的亲和力高、特异性强,在制备及稳定性等方面优于抗体。基于适配子的生物芯片、生物传感器、分子信标等检测新技术已初步显示出良好的敏感性和特异性,在人类疾病诊断中具有良好的应用前景。

关键词：指数富集配体的系统进化技术核酸适配子诊断