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SELEX技术及近年研究进展

病毒学报 2013年第5期29卷 573-577页

作者：詹少兵曾毅中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052

指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是近20年来出现的一种新型体外筛选技术。该技术将文库技术与筛选技术相结合,从核酸文库中筛选出的一段核酸分子:配基-适配子(aptamer);适... 详细信息

指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是近20年来出现的一种新型体外筛选技术。该技术将文库技术与筛选技术相结合,从核酸文库中筛选出的一段核酸分子:配基-适配子(aptamer);适配子与抗体类似,可以与相应靶物质特异性结合。SELEX技术筛选适配子的技术有快速的进步,而适配子也被应用到医学生物学等各个方面。在HIV等病毒学研究与治疗方面,SELEX的应用也有了可观的进展,多种病毒的相关适配子被筛选出来,为病毒相关疾病的防治提供了新的方向。本文主要就近三年来的SELEX技术发展状况及在应用上的发展进行简要综述。

关键词：指数富集的配体系统进化适配子

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核酸适配子在疾病诊断研究中的应用

中南大学学报（医学版） 2014年第3期39卷 320-324页

作者：张攀张焜和南昌大学第一附属医院消化内科南昌330006

核酸适配子是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术从单链随机寡核苷酸文库中筛选得到的单链寡核苷酸配体,其与靶标的结合具有高特异性及高亲和力等优点,使其能广泛地应... 详细信息

核酸适配子是通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术从单链随机寡核苷酸文库中筛选得到的单链寡核苷酸配体,其与靶标的结合具有高特异性及高亲和力等优点,使其能广泛地应用于疾病诊断研究。适配子在生化检测、新肿瘤标志物发现、分子成像、病原微生物检测等领域的研究应用中均有报道,并显示出良好的应用前景。

关键词：适配子指数富集的配体系统进化靶标诊断

SELEX技术及寡核苷酸适配体的近期研究进展

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国际药学研究杂志 2010年第4期37卷 249-256页

作者：郭磊军事医学科学毒物药物研究所八室北京100850

指数富集的配体系统进化(SELEX)技术是一类具备蓬勃发展前景的体外筛选技术,在生物学、药学及化学领域已引起广泛关注。本文即针对2004年以来SELEX技术的发展特点,主要介绍两类新型SELEX策略,即毛细管电泳-SELEX和针对复杂靶标的SELEX方... 详细信息

指数富集的配体系统进化(SELEX)技术是一类具备蓬勃发展前景的体外筛选技术,在生物学、药学及化学领域已引起广泛关注。本文即针对2004年以来SELEX技术的发展特点,主要介绍两类新型SELEX策略,即毛细管电泳-SELEX和针对复杂靶标的SELEX方法,并简要总结了寡核苷酸适配体在生物医学和药学相关方面的最新应用进展。

关键词：指数富集的配体系统进化寡核苷酸适配体肿瘤靶向生物医学药物学

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河豚毒素适体的SELEX筛选与应用研究

河豚毒素适体的SELEX筛选与应用研究

作者：王云才福建农林大学

学位级别：硕士

本文应用核酸适体筛选技术(SELEX技术),从庞大的随机ssDNA文库中筛选获得与河豚毒素(TTX)具有特异性强、亲和力高的寡核苷酸适体(aptamer),并对其应用进行初步探索,为应用核酸适体检测河豚毒素奠定基础。人工合成两端为固定序列、中间... 详细信息

本文应用核酸适体筛选技术(SELEX技术),从庞大的随机ssDNA文库中筛选获得与河豚毒素(TTX)具有特异性强、亲和力高的寡核苷酸适体(aptamer),并对其应用进行初步探索,为应用核酸适体检测河豚毒素奠定基础。人工合成两端为固定序列、中间为35个随机序列、全长为78nt的ssDNA文库,用环氧基树脂(Epoxy)活化的丙烯酸珠子作为固相分离介质偶联河豚毒素,结合诱变PCR技术,进行河豚毒素适体的SELEX筛选。筛选过程中优化了PCR扩增条件以及用Epoxy活化丙烯酸珠子偶联甘氨酸并进行反筛。经过13轮的筛选,对获得的适体群进行克隆,随机挑取19个克隆子,经鉴定后测序。对测序合格的适体进行一级结构和二级结构分析以及亲和力测定。基于绿色荧光核酸染料EvaGreen与核酸适体-TTX复合物的作用,建立了 TTX的适体荧光检测方法。SELEX筛选结果表明,每轮ssDNA的富集文库与靶分子的结合率呈上升趋势,结合显色后吸光度值从第1轮的0.235上升到第13轮的0.936,提高了 4.0倍。通过对一级结构的同源性分析,发现有6条适体序列几乎完全相同(其中有4条序列完全一致,其余2条仅有1～2个碱基的差异)、3条适体序列完全一致,表明一级结构相同或相近的适体在一定程度上得到富集。适体结构模拟显示二级结构主要以茎环状结构为主,表明这些茎环结构是适体与靶分子结合的基础。适体与靶分子的结合试验表明,A3号单克隆适体的结合率最大。适体荧光检测方法优化结果表明:A3号单克隆适体与TTX结合的最适pH值为7.5,染料最佳结合时间为1Omin,检测低限为10mol/L。

关键词：河豚毒素适体指数富集的配体系统进化荧光染料

高尔基体蛋白73的原核表达及其适配子的筛选与鉴定

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高尔基体蛋白73的原核表达及其适配子的筛选与鉴定

作者：蔡媛媛广州医学院

学位级别：硕士

研究目的构建pET-32a(+)-GP73原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化重组GP73;构建单链DNA(ssDNA)文库，以重组GP73为靶标，采用SELEX技术筛选与GP73亲和力强的适配子，并对所筛选的适配子进行结合率的检测，初步运用于临床正常胆管和... 详细信息

研究目的构建pET-32a(+)-GP73原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化重组GP73;构建单链DNA(ssDNA)文库，以重组GP73为靶标，采用SELEX技术筛选与GP73亲和力强的适配子，并对所筛选的适配子进行结合率的检测，初步运用于临床正常胆管和肝癌组织标本的免疫组化分析，为进一步建立基于适配子的肝癌新标志物GP73的免疫检测方法奠定基础。方法一、pET-32a(+)-GP73原核表达载体的构建及GP73的表达和纯化 (1)以GP73基因开放读码框为靶序列，设计相应引物，PCR扩增GP73基因。 (2)将GP73基因与pMD-19T载体相连，转化入质粒保存菌DH5α中，筛选出与pMD-19T连接成功的单克隆菌株。 (3)经测序正确后提取pMD-19T/GP73重组质粒，双酶切处理所提取的质粒，行琼脂糖电泳回收GP73基因片段，构建pET-32a(+)-GP73原核表达载体，转化原核表达菌种BL21 (4)调整IPTG终浓度分别为0.2mmol/L、0.6mmol/L、1.0mmol/L，诱导表达时间分别为2h、4h、6h，经SDS-PAGE分析后，选择最适诱导浓度和表达时间作为实验条件，用Ni-NTA亲和柱纯化表达蛋白，Western-blot对GP73进行鉴定，并利用GP73检测试剂盒测定纯化蛋白的浓度。二、随机文库的构建以及GP73适配子的筛选 (1)设计合成全长为85bp的单链DNA(ssDNA)文库，两端分别为序列固定的20个碱基，以便设计相应的PCR引物，中间45个碱基为随机序列，整个文库容量达到了45;(2)以重组人GP73为靶分子，将纯化的GP73包被于96孔板上，同时设立BSA空白对照孔，经反筛将未与空白对照孔结合的ssDNA放入包被有GP73的板孔中孵育，洗涤后仅有极少数序列与靶蛋白结合，洗脱出与GP73结合的ssDNA，用5端标记有生物素的下游引物和正常的上游引物进行PCR，将ssDNA扩增为dsDNA，此时非文库链的5端即可标记上生物素;(3)将上述步骤所得的PCR产物与链霉亲和素磁珠混合，PCR产物通过生物素与磁珠上的亲和素结合，此时加入适量的碱性溶液，使dsDNA解链成ssDNA，5端标记有生物素的非文库链仍然与磁珠相连，而文库链游离在溶液中，利用磁力架吸引磁珠分离出文库链，获得次一级ssDNA候选库。 (4)将次一级ssDNA候选库再与GP73温育，进入第二轮筛选。如此循环，随着筛选轮数的不断增加，低亲和力序列逐渐被淘汰。经过大约6-12轮筛选后，与GP73结合力强的适配子得到富集，结合率达到饱和，停止筛选。三、运用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体系统检测不同筛选轮数所得文库与GP73的结合率 (1)保留1、3、5、6、8、10轮筛选文库，用5端地高辛修饰的上游引物和5端生物素修饰的下游引物对上述文库分别进行PCR扩增，获得的PCR产物，非文库链5端为生物素修饰，文库链为地高辛修饰，然后利用磁珠磁力架系统，分离出地高辛标记的文库链 (2)分离出的文库链分别与GP73进行孵育，洗涤后加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体进行反应，以PNPP显色，终止反应后用酶标仪测定405nm OD值。 (3)根据测得的OD值做图分析，选择结合率较高并趋于较稳定的筛选文库的进行克隆、测序。 (4)分析测序所得ssDNA的二级结构，找到与GP73结合较理想的ssDNA作为GP73适配子，并根据非竞争性ELISA法摸索筛选的适配子与重组GP73的亲和常数。四、阻断实验和免疫组化实验对GP73适配子结合特异性的鉴定 (1)将GP73多克隆抗体稀释成不同浓度，分别与包被有相同浓度GP73的板孔孵育，洗涤后依次向各孔中加入固定浓度的适配子，观察在不同浓度的多克隆抗体阻断下适配子与GP73结合率的变化。 (2)将筛选所得的适配子用生物素标记后运用于临床正常胆管和肝癌组织的免疫组化分析，观察其是否能与组织中的GP73蛋白相结合。研究结果 (1)成功扩增出GP73基因1200bp，与理论值相符，将其与pMD-19T相连，测序无突变 (2)双酶切回收GP73基因片段，成功构建了pET-32a-GP73原核表达载体。 (3)经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析显示，在诱导菌夜上清中出现蛋白分子量约为68Kd目的蛋白，与预期值相符。 (4)SDS-PAGE分析显示，经Ni-NTA亲和柱纯化后，绝大部分杂蛋白被去除，重组GP73蛋白得到了很好的纯化，Western blot检测证明重组GP73能够很好的与GP73多克隆抗体结合，GP73检测试剂盒分析得到纯化蛋白浓度为2μg/ml。 (5)经过10轮的筛选，运用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体系统检测1、3、5、6、8、10轮筛选文库与GP73结合率，随着筛选轮数的不断增加，适配子

关键词：重组GP73 文库指数富集的配体系统进化磁珠亲和常数免疫组化

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核酸适体及其在食品安全领域的应用

安徽科技学院学报 2013年第5期27卷 38-44页

作者：王丽桑宏庆安徽科技学院食品药品学院安徽凤阳233100

核酸适体作为一种具有替代抗体潜能的新型仿生生物识别元素,是近年来研究的热点。在食品安全领域,抗生素、重金属、食源性致病菌、生物毒素等多种物质的核酸适体已被成功筛选和应用。本文介绍了核酸适体的特点和优势、识别靶分子的机制... 详细信息

核酸适体作为一种具有替代抗体潜能的新型仿生生物识别元素,是近年来研究的热点。在食品安全领域,抗生素、重金属、食源性致病菌、生物毒素等多种物质的核酸适体已被成功筛选和应用。本文介绍了核酸适体的特点和优势、识别靶分子的机制、体外筛选的流程,综述了核酸适体在食品安全领域的应用研究进展。

关键词：核酸适体食品安全分子识别指数富集的配体系统进化

SELEX技术在病毒感染诊断和治疗中的应用

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生物技术通讯 2009年第5期20卷 745-748页

作者：甘龙杰兰小鹏福建医科大学福州总医院临床医学院福建福州350025 南京军区福州总医院全军医学检验研究所福建福州350025

指数富集的配体系统进化(SELEX)技术是一种新的组合化学技术,它利用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外多轮筛选与扩增,获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适体。适体的靶分子广泛,包括病毒代谢相关产物,且与靶物质结合的亲和力高、... 详细信息

指数富集的配体系统进化(SELEX)技术是一种新的组合化学技术,它利用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外多轮筛选与扩增,获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适体。适体的靶分子广泛,包括病毒代谢相关产物,且与靶物质结合的亲和力高、特异性强,在体内代谢及稳定性等方面优于抗体。在细胞和动物模型中,适体显示出很多优于抗体的特性,而且已经有适体作为药物进入临床试验阶段。这种体外筛选技术是一种较成熟的技术,由此产生的适体具有较好的理化特征,可以抑制病毒复制感染的各个阶段,而且在病毒感染所引发的相关疾病诊断和治疗等方面具有较好的应用前景。

关键词：指数富集的配体系统进化适体病毒诊断治疗

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以完整细胞为靶子的SELEX技术研究进展

生物技术通讯 2009年第6期20卷 870-873页

作者：李慧李少华王鸣刚邵宁生兰州理工大学生命科学院甘肃兰州730050 军事医学科学院基础医学研究所北京100850

指数富集的配体系统进化(SELEX)是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力、高特异性核酸配基——适配体的体外筛选技术。自1990年以来,SELEX技术得到了迅猛发展,筛选的靶分子已由最初的单一物质发展到... 详细信息

指数富集的配体系统进化(SELEX)是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力、高特异性核酸配基——适配体的体外筛选技术。自1990年以来,SELEX技术得到了迅猛发展,筛选的靶分子已由最初的单一物质发展到完整的动物细胞、细菌病原体等复杂靶子。以完整细胞为靶子的SELEX技术有其独特的技术优势,可以在筛选细胞上特定靶分子未知的情况下进行筛选,为药物筛选、临床诊断、疾病治疗和基础医学研究等带来了新的思路和方法。随着对适配体研究的深入,尤其是纳米材料与其相结合应用,该技术将在肿瘤诊断治疗及微生物检测领域具有更为广泛的应用前景。

关键词：指数富集的配体系统进化完整细胞适配体肿瘤诊断微生物检测

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SELEX技术在毒理学研究中的应用

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