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结核杆菌Pup-蛋白酶体系统与结核杆菌持留性的相关性研究

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中国免疫学杂志 2015年第4期31卷 447-452页

作者：朱彬雷英吴芳张辉张春军章乐吴江东曹旭东邬博何丽张玉清李瑞山王钊张万江石河子大学医学院病原生物学教研室石河子大学<新疆地方与民族高发病>教育部重点实验室石河子832002 石河子市人民医院老年病一科石河子832000

目的:本研究通过诱导结核杆菌在低氧环境中进入持留状态,比较分析不同时间点、不同环境下结核杆菌Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达水平差异,探讨研究Pup-蛋白酶体系统对结核杆菌持留性的调控作用。方法:本实验以结核杆菌国际标准强毒株H... 详细信息

目的:本研究通过诱导结核杆菌在低氧环境中进入持留状态,比较分析不同时间点、不同环境下结核杆菌Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达水平差异,探讨研究Pup-蛋白酶体系统对结核杆菌持留性的调控作用。方法:本实验以结核杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株(以下简称为H37Rv菌株)为研究对象,在低氧、有氧环境下进行培养,分别提取不同时间点每组样本菌株的总RNA,并进行纯度鉴定。运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的方法,分别检测各组结核杆菌菌株的Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达;比较分析不同时间点、不同环境下的各结核杆菌菌株Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的表达水平差异。结果:在不同时间点对低氧环境下菌株Pup、Dop、Paf A和Mpa的表达水平进行检测,Pup、Dop、Paf A和Mpa基因的相对表达水平:低氧环境下,与0 d比较,Pup基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.66、2.43、2.76倍,Dop基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.38、1.91、2.54、3.28倍,Paf A基因在2 d、4 d、7 d、10 d分别上调1.22、1.75、2.37、2.67倍,Mpa基因在4 d、7 d、10 d分别上调1.66、2.21、2.63倍(P持留性具有一定的调控作用。

关键词：结核杆菌 Pup-蛋白酶体系统持留性

PhoPR双组分信号转导系统对结核分枝杆菌持留性的调控机制研究

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中国人兽共患病学报 2015年第2期31卷 116-120,142页

作者：邬博雷英吴芳章乐吴江东曹旭东朱彬何丽李瑞山张玉清王钊王君柳小玲张培培梁粟张万江石河子大学医学院微生物学与免疫学教研室石河子大学<新疆地方与民族高发病>教育部重点实验室石河子832000 石河子市人民医院老年病一科石河子832000

目的本研究通过诱导结核分枝杆菌在低氧环境中进入持留状态,来比较分析不同时间不同低氧环境下结核分枝杆菌中的PhoP基因和PhoR基因的表达水平差异,探讨研究PhoPR双组分信号转导系统对结核分枝杆菌持留性的调控机制。方法首先对结核分... 详细信息

目的本研究通过诱导结核分枝杆菌在低氧环境中进入持留状态,来比较分析不同时间不同低氧环境下结核分枝杆菌中的PhoP基因和PhoR基因的表达水平差异,探讨研究PhoPR双组分信号转导系统对结核分枝杆菌持留性的调控机制。方法首先对结核分枝杆菌国际标准无毒株(H37Ra)和结核分枝杆菌国际标准强毒株(H37Rv)在不同低氧环境下进行培养,提取每个样本菌株的总RNA,并进行完整性鉴定;运用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测每个样本菌株中PhoP基因和PhoR基因的表达水平;比较分析不同时间不同低氧环境下的结核分枝杆菌菌株PhoP基因和PhoR基因的表达水平差异。结果在不同时间点对低氧环境的结核分枝杆菌PhoP基因和PhoR基因的表达水平进行检测,结果显示:与第10d相比,培养至第15d时H37Rv菌株和H37Ra菌株中的PhoP基因和PhoR基因的表达水平均显著上调,差异有统计学意义(P持留性具有调控作用。

关键词：结核分枝杆菌持留性 PhoPR双组分信号转导系统

《结核分枝杆菌持留性、潜伏性和药物耐受性》一文读后感

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中华结核和呼吸杂志 2005年第2期28卷 141-143页

作者：潘毓萱陆宇北京市结核病胸部肿瘤研究所基础部 101149

友人命读 Gomez和McKinney教授撰写的[1]一文并报告读后感.此文长达数万言,涉猎文献前后竟数十年,但读来兴致绵绵,收获颇丰,确是一篇对结核病的持留性和持留菌作了全面论述和有深度认识的文献.国内众多学者也在酝酿和正进行有关结核病... 详细信息

友人命读 Gomez和McKinney教授撰写的[1]一文并报告读后感.此文长达数万言,涉猎文献前后竟数十年,但读来兴致绵绵,收获颇丰,确是一篇对结核病的持留性和持留菌作了全面论述和有深度认识的文献.国内众多学者也在酝酿和正进行有关结核病持留性领域的工作,但尚难见有这样深刻认识的论述.或许这也正是国内研究难以超越的一个重要原因.

关键词：结核分枝杆菌持留性潜伏性药物耐受性厌氧代谢结核病

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结核分枝杆菌持留性和持留菌的界定

中华结核和呼吸杂志 2004年第4期27卷 264-266页

作者：潘毓萱北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫室 101149

结核分枝杆菌耐药性和持留性是关系结核病临床疗效和结核病流行控制的两大课题.经过数十年的研究,在细节上虽仍有待继续深入,但在总体上人们对抗结核药物作用和耐药机制的认识已较为明确.与此相比,虽然对持留现象和持留菌的认知由来已久... 详细信息

结核分枝杆菌耐药性和持留性是关系结核病临床疗效和结核病流行控制的两大课题.经过数十年的研究,在细节上虽仍有待继续深入,但在总体上人们对抗结核药物作用和耐药机制的认识已较为明确.与此相比,虽然对持留现象和持留菌的认知由来已久,近数年来也已进入现代研究的过程,但大体上仍然是一片迷蒙,学界甚至对持留现象和持留菌仍无明晰的界定.

关键词：结核分枝杆菌持留性持留菌界定结核病

阿特拉津在土壤中的降解途径及其对持留性的影响

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农村生态环境 1995年第4期11卷 5-8页

作者：乔雄梧马利平山西省农业科学院植物保护研究所

通过田间和实验室试验，研究了除草剂阿特拉津在土壤中的降解代谢规律及其与土壤特性的关系。试验表明，阿特拉津施用后、在作物生长期内可降解９０％以上，土壤酸碱度对阿特拉津在土壤中的代谢有显著影响。在碱性土壤中阿特拉津主要经... 详细信息

通过田间和实验室试验，研究了除草剂阿特拉津在土壤中的降解代谢规律及其与土壤特性的关系。试验表明，阿特拉津施用后、在作物生长期内可降解９０％以上，土壤酸碱度对阿特拉津在土壤中的代谢有显著影响。在碱性土壤中阿特拉津主要经过微生物代谢而被降解；在酸性土壤中化学水解占优势地位。阿特拉津在强酸性土壤中的持留性（半衰期为６３ｄ）低于弱酸性土壤中的持留性（半衰期为８４ｄ），而在碱性土壤中由于较强的微生物降解作用，其持留性（半衰期为５１ｄ）最低。

关键词：阿特拉津代谢产物土壤持留性降解除草剂

金黄色葡萄球菌转座子突变文库构建与持留性突变株研究

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金黄色葡萄球菌转座子突变文库构建与持留性突变株研究

作者：姜北第三军医大学

学位级别：硕士

持留菌(persisters/persister cells)是存在于细菌群体中的一部分表型变异亚群，可以耐受致死浓度抗菌药物的作用而存活下来。由于持留菌的存在，抗菌药物的杀菌曲线常呈现出双相性，即初期由于正常细菌的大量死亡曲线呈现出快速下降趋... 详细信息

持留菌(persisters/persister cells)是存在于细菌群体中的一部分表型变异亚群，可以耐受致死浓度抗菌药物的作用而存活下来。由于持留菌的存在，抗菌药物的杀菌曲线常呈现出双相性，即初期由于正常细菌的大量死亡曲线呈现出快速下降趋势，后期由于持留菌的存在，曲线呈现出比较平缓稳定的趋势。持留菌不具有遗传稳定性，当存活下来的持留菌被再次接种到新鲜培养基后，细菌中仍只有一小亚群为持留菌，而细菌对抗菌药物的最低抑菌浓度无变化。持留菌与生物被膜形成及其相关感染具有密切关系，也是难治性慢性感染的重要凶手，其在抗感染治疗中的重要地位逐渐被认可，甚至有学者认为细菌持留性在临床上的重要性并不亚于细菌抗菌药物耐药性。持留菌最初由Bigger于1944年在葡萄球菌的杀菌实验中发现，但长期以来持留菌的研究却以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及结核分枝杆菌为主。金黄色葡萄球菌(简称金葡菌;Staphylococcus aureus)是医院内感染和社区获得性感染的重要病原菌之一，既可引起皮肤、粘膜等处的轻型化脓性感染，也可导致菌血症、毒性休克综合征等危及患者生命的严重疾病。而耐药性的产生与广泛传播严重干扰着金葡菌的临床防治，使得近年来金葡菌感染逐步呈现发病率高、耐药性强、治疗困难、病死率高的态势。基于持留菌及金葡菌在临床感染性疾病中的重要地位，探寻金葡菌持留菌的形成机制对于有效控制金葡菌感染具有重要意义。探寻持留菌的形成机制，关键在于分离鉴定与持留菌形成相关的基因。而文库筛选是鉴定持留相关基因的最常用方法。在既往研究中，已有学者通过建立大肠埃希菌或铜绿假单胞菌的转座子突变文库、定点突变文库及表达文库筛选得到了一些与细菌持留性相关的基因，这些基因的发现极大地促进了人们对持留菌的认识。基于以上考量，我们拟通过建立金葡菌转座子突变文库筛选鉴定金葡菌持留性相关基因，而文库的建立不仅可以用于筛选持留突变株，更可广泛用于其他研究。为了规避文库筛选可能存在的不确定性，我们同时进行了金葡菌持留相关基因的定点研究。目前已知的持留性相关基因中，有很多与细菌的代谢活动相关，学术界目前普遍认为细菌的代谢活动与细菌持留性之间有着密切的关系。细菌的能量生成、氨基酸代谢、三磷酸甘油代谢、严谨反应等代谢活动的异常使得细菌进入非正常的生理状态，从而导致细菌持留菌的产生。基因glpD编码产物GlpD为三磷酸甘油脱氢酶，在细菌的代谢活动中具有重要作用，其很可能与细菌的持留性相关。glpD基因对E.coli持留性的作用已经有所研究，虽然可以肯定glpD在细菌持留水平的调节上发挥着某种作用，但具体是正性还是负性作用尚存争议。目前关于金葡菌glpD基因在持留性上的作用还无人涉足。为此，我们拟深入研究glpD基因在金葡菌持留菌形成中发挥的作用，以更好地揭示glpD基因与细菌持留性的关系，同时为探明金葡菌持留菌的形成机制提供借鉴。本论文的第一部分我们利用转座子Tn917构建了金葡菌Newman株转座子突变文库，从该文库中得到了持留性突变菌株，对其进行了分析讨论;同时，我们以构建的转座子为工具，筛选得到了一株DAP耐药突变株。第二部分我们通过构建glpD敲除株及进行持留性对比实验，首次阐释了glpD基因在金葡菌持留菌形成中的作用。主要的研究内容和结果如下： 1.金黄色葡萄球菌转座子突变文库的构建与应用 (1)构建金葡菌Tn917转座子突变文库：将含有转座子Tn917的温敏穿梭质粒pID408先电转化入金葡菌RN4220，经其对质粒进行修饰后，再将质粒提取并电转化入金葡菌Newman株，通过高温及红霉素诱导转座子发生转座作用，从而得到含有大量转座子插入突变的文库。文库初步建立后，我们对文库质量进行了评价，文库子数量远足以满足实验需求，同时经鉴定文库子转座子插入随机性也较好，故文库的可应用性得到了保证。 (2)通过文库获得持留突变菌株，发现持留相关基因pyrD：在文库的评价鉴定过程中，我们发现了一株pyrD基因插入突变株(T18)。pyrD基因与细菌的呼吸作用及嘧啶合成代谢过程密切相关，鉴于持留菌与细菌代谢活动的密切关系，我们将该突变株作为持留性实验对象之一。同时由于嘧啶合成缺陷及呼吸链受损菌株在某些特殊情况下会产生小菌落变异等变化，从而影响细菌对抗菌药物的敏感性，故我们将T18株经环丙沙星作用后得到了其衍生株T18s。我们比较了野生株、T18、T18s株的24h和36h菌液的持留性，结果发现：①比较处于24h时间点的这三株细菌，24h的T18株活菌数量虽然相较野生株与T18s株偏少，但其经8h DAP作用后，剩余的活菌数量却是最多的，即T18株的持留性是最高的。而到了培养36h后，三株细菌的持留性对比关系发生了很大变化。②将培养36h的三株细菌的持留性与24h对应菌株的持留性进行比较，可见T18株的持留性显著降低，而T18s株的持留性并未产生显著变化，尤其值得注意的是，野生株的持留性升

关键词：持留菌持留性金黄色葡萄球菌转座子文库基因敲除 glpD基因

毒素—抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究

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毒素—抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究

作者：申爱平石河子大学

学位级别：硕士

目的:本研究拟通过构建结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株,初步研究其在不同培养条件下对结核分枝杆菌生存能力的影响,并对毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性相关性进行初步探讨。方法:1.结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株的构建... 详细信息

目的:本研究拟通过构建结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株,初步研究其在不同培养条件下对结核分枝杆菌生存能力的影响,并对毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性相关性进行初步探讨。方法:1.结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株的构建及鉴定。首先以聚合酶链反应(PCR)分别从H37Rv标准株和PUC-19K质粒上扩增出目的基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;然后应用融合PCR技术将目的基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF-kan和自杀质粒p MD-19T-Δrel BE-kan,并将自杀质粒分别转化至大肠杆菌DH5a中;最后利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv感受态细胞中;在卡那霉素抗性改良罗氏培养基上筛选出H37RvΔmaz EF和H37RvΔrel BE缺失突变株单个菌落,提取阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段并测序,并对所获得H37RvΔmaz EF和H37RvΔrel BE缺失突变株进行遗传稳定性检测。2.结核分枝杆菌H37RvΔMaz EF缺失突变株的生长表型和在不同培养条件下生存能力的初步检测。分别对野生型和缺失株进行抗酸染色,镜下观察菌株形态学的改变;分别在低氧和营养缺乏的培养基中培养缺失株和野生株,并在不同的时间点对菌落进行计数,比较野生株和缺失株在应激条件下,生存能力是否存在差异。3.分别用H37Rv、H37RvΔmaz EF3、H37RvΔmaz EF6和H37RvΔmaz EF9菌株感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过CFU计数初步检测结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细菌的生存能力;利用流式细胞仪CELLQest和Win MDl2.9 Version软件检测巨噬细胞感染后的凋亡情况。结果:经传代15代后,再次测序,未发生回复性突变,得到具有遗传稳定性的H37RvΔMaz EF和H37RvΔRel BE基因缺失株。抗酸染色显示,H37RvΔmaz EF菌株较野生菌株其形态短小;同时,CFU计数结果显示缺失菌株生长缓慢。细菌感染巨噬细胞后,缺失株在巨噬细胞内的生存能力低于野生菌株,且H37RvΔmaz EF菌株感染组,巨噬细胞的凋亡率高于H37Rv菌株感染组。结论:maz EF毒素-抗毒素系统有助于结核分枝杆菌在应激环境下的持留生存。研究结果表明了结核分枝杆菌感染机体后的持留性及其潜伏感染是多因素相互作用的结果,确切的感染机制有待于进一步研究。

关键词：结核分枝杆菌 mazEF基因 relBE基因同源重组持留性

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结核分支杆菌持留性和持留菌的界定

结核病与胸部肿瘤 2003年第3期 166-170页

作者：陆宇潘毓萱北京市结核病胸部肿瘤研究所

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溶剂持留性

杭州化工 1989年第3期19卷 33-34,32页

作者：曹若梅董廉观杭州油墨油漆厂

在最近十年中对溶剂持留性的研究已成为包装工业的一个日益重要的部分。距今10至12年前,印刷者、油墨制造者,印品购买者和消费者都默认一个虽稍了解而当时又难于控制的问题。对薄膜印刷者来讲,甲苯是一种常用的油墨溶剂,可生产廉价的油... 详细信息

在最近十年中对溶剂持留性的研究已成为包装工业的一个日益重要的部分。距今10至12年前,印刷者、油墨制造者,印品购买者和消费者都默认一个虽稍了解而当时又难于控制的问题。对薄膜印刷者来讲,甲苯是一种常用的油墨溶剂,可生产廉价的油墨,且具有优良的运转性能并且对当天的薄膜有良好的粘附性。唯一有效的测量设备就是人的鼻子。

关键词：溶剂持留性