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小毛莨内酯对重组耻垢分枝杆菌eis基因表达影响的研究

小毛莨内酯对重组耻垢分枝杆菌eis基因表达影响的研究

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作者：王开金重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：结核病病程的延绵和复发所显示的持留现象，已经是久为人知的临床事实，但至今对结核分枝杆菌持留菌本质、发生机制及临床治疗仍无确切的认识和明确的界定，尤其是在结核分枝杆菌持留菌的临床药物治疗方面，几乎处于停滞状态... 详细信息

目的：结核病病程的延绵和复发所显示的持留现象，已经是久为人知的临床事实，但至今对结核分枝杆菌持留菌本质、发生机制及临床治疗仍无确切的认识和明确的界定，尤其是在结核分枝杆菌持留菌的临床药物治疗方面，几乎处于停滞状态，目前为止，还没有针对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）持留菌的有效药物，而研究发现MTB能够进入巨噬细胞，并且进入巨噬细胞后，由于特殊的基因在巨噬细胞内的表达，从而达到适应巨噬细胞胞内环境从而达到持留作用。而近期的研究发现eis（Enhance intracellular survival）基因特异性的表达于致病的MTB复合群，具有提高MTB在巨噬细胞中的生存能力，能够达到长期持留。eis基因产物是一种可溶性分泌型蛋白，分子量约为42kd，能作用于巨噬细胞内及细胞外，有研究证实该种42kd蛋白能够影响巨噬细胞白介素（interlukin,IL）-10及肿瘤坏死因子（tunlornecrosisfactor，TNF）-a分泌，抑制巨噬细胞活化，于MTB的持留有一定关系。在机体免疫力下降时，持留MTB就会在体内复燃，发生结核病，结核病有卷土重来的趋势，其发病率及死亡率明显上升，持留态结核分枝杆菌是结核病内源性复燃和病程绵延的根源，以增殖期结核分枝杆菌为靶标的抗结核药对处在非增殖期的持留态MTB无效，这是目前全球防治结核病的主要障碍之一。近年来中草药在结核病的慢性感染治疗中日益得到重视，研究发现猫爪草的有效成分小毛莨内酯（Ternatolide，Tern）能显著增强细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxiclymphocyte,CTL）杀菌能力，达到杀灭持留菌作用[3]，我们的前期实验研究表明MTBeis（Enhance intracellular survival，eis）基因特异性表达于致病MTB复合群，具有提高MTB在巨噬细胞中的生存能力，与MTB的持留性密切相关。 Tern是从猫爪草（Ranunculus ternatus Thunb）的有效成分，祖国医学认为其性味辛甘，并有化痰散结、解毒消肿，归类于养阴药，临床主要用于治疗肺结核、淋巴结结核，而Tern对eis基因的影响目前尚无研究，本实验旨在探索Tern对重组耻垢分支杆菌（Mycobacteriumsmegmatis，MS）生长增殖情况、eis基因、蛋白表达的影响。进一步研究猫爪草对持留分支杆菌的有效成分、作用机理及作用强度。方法： 1从平板上挑取5×105MS-eis-PMV261分别接种于有Tern（200mg/L）卡那霉素抗性的LB肉汤培养基中作为试验组，MS-eis-PMV261单独培养作为对照组，同样于37℃，250r/min震摇培养，于第1、2、3、4、5和6天在两组中各取200μL测量菌液在波长600nm处A值，根据所测A值绘制增殖曲线。 2提取菌液DNA以RT-PCR方法检测Tern对eis基因表达的影响取培养6天Tern干预的试验组及对照组各3ml离心收集菌液后提取细菌DNA，溶于20ul双蒸水中。取1ul为模板RT-PCR扩增eis基因。eis基因的检测引物序列为上游：5’-ATGTTCCTACTGGCCGCGGC-3’;下游：5’–TCAGAACTCGAACGCGGTCTGG-3’。PCR反应条件为：95oC预变性3min;95oC变性30s，60oC退火30s，72oC延伸30s,共35个循环后再72oC延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析，并以Quantity One软件分析其条带灰度值量化基因表达水平。 3免疫印迹法SDS-PAGE及western blot检测Tern对EIS蛋白表达的影响分别取培养6天的3ml菌液以12000g,2min离心保留细菌及30ul菌液并加入5x蛋白上样缓冲液后沸水浴10min。电泳开始前，配制12%的分离胶以及5%的浓缩胶，收集的菌液蛋白离心后取上清，并进行SDS-PAGE电泳，电泳后，使用R-250考马斯亮蓝染色30min,脱色液脱色过夜后观察两组间42kd处蛋白表达情况。采用半干电转移方式将蛋白条带转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，以稀释的痰菌阳性结核患者血清（1:100）为一抗，过氧化物酶标记的羊抗人IgG（1:5000）为二抗，用DAB显色观察并分析蛋白条带。 4统计学方法数据以均数标准差x±s表示,采用SPSS18.0统计软件,两组间比较进行t检验。结果： 1Tern干预的试验组与未干预对照组MS-eis-PMV261的增殖曲线无明显差异。 2在给予Tern试验组eisDNA条带与对照组比较明显减弱。 3菌液处理后行SDS-PAGE电泳及western blot，结果显示含EIS基因的MS-eis-PMV261未给予Tern药物干预独立培养的对照组在42ku处可表达

关键词：持留分枝杆菌 eis基因小毛莨内酯

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